4.4. Окрашивание гистопрепаратов
Методы окрашивания выбираются, исходя из состава исследуемых тканей и основаны на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям.
Окраска гематоксилин-эозином. Наиболее распространенный метод окрашивания срезов, содержащих любые виды тканей. Этот метод применяется для обзорных исследований, позволяет установить отношения между частями тканей, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Окраска гематоксилин-эозином применяется практически во всех случаях, независимо от поставленной задачи. В большинстве случаев для изучения структуры нормальной или измененной в результате болезни ткани копытец ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда стоит специальная задача, например, выявить виды волокон, пользуются специальными методами окрашивания, но в то же время параллельно окрашивают ряд срезов гематоксилин-эозином. Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры. Замороженные гистосрезы мы окрашивали автоматически на аппарате HMS 70 фирмы MICROM. Порядок проведения окраски: 1. Раствор гематоксилина (5 мин.). 2. Водопроводная вода (1 мин.). 3. Эозин (5 сек.). 4. Водопроводная вода (1 мин.). 5. Дистиллированная вода (30 сек.). 6. Сушка (15 мин.). 7. 96% спирт (5 сек.). 8. Сушка (10 мин.). 9. Ксилол (10 сек.). 10. Сушка (10 мин.). 11. Заключение в бальзам или полистирол. Результат окрашивания: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые. Пример окрашивания:
1 - сосочковый слой; 2 - сетчатый слой
Рисунок 4.4.1 - Микрофото. Основа кожи пальцевого мякиша анатомически правильного копытца. Окраска гематоксилин-эозином. Х-250
Гистохимические методы окрашивания основаны на специфическом окрашивании исследуемых тканей определенными красителями. В наших исследованиях мы применяли гистохимические исследования для выявления и подсчета удельной площади коллагеновых и эластических волокон, вакуолей жира.
Окрашивание жиров и липидов. Суть методов заключается в том, что вещества, красящие жиры, хорошо в них растворяются и поэтому легко переходят из раствора в липиды.
Окрашивание Суданом III. Является наиболее распространенным методом
выявления жира.
Приготовление раствора красителя. В 100 мл горячего 70% спирта засы
пают 0,2-0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат
(при 58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.
Порядок проведения окраски:
1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани)
ополоснуть в 50% спирте (30-60 сек.).
2. Поместить в свежеприготовленный раствор судана III на 5-20 мин (бюксы
следует закрывать, так как испарение спирта приводит к выпадению осадков краси
теля).
3. Быстро ополоснуть в 50% спирте (30 сек.).
4. Промыть в водопроводной воде (10-30 мин.).
5. Поместить в гематоксилин (30 сек .-3 мин.).
6. Промыть в водопроводной воде (3-5 мин.).
7. 1% раствор соляно-кислого спирта (3-5 сек.) - если срезы перекрашены!
8. Заключить гистосрезы в желатин, глицерин или глицерин-желатин.
Примечание: препараты сравнительно быстро выцветают, поэтому отклады
вать исследование не рекомендуется.
Результат окрашивания:жировые вещества интенсивно оранжевого цвета, ядра -
синие.
Пример окрашивания:
Рисунок 4.4.2 - Микрофото. Жировые вакуоли подошвенной части пальце
вого мякиша анатомически правильных копытец. Окраска суданом III. Х-
250
РЕПОЗИТОРИЙ УО ВГАВМ
Окраска нейтральных жиров жировым красным (OIL RED) по Лилли. Фиксирование тканей проводить только в кальций-формоле, гистосрезы готовить на замораживающем микротоме. Преимущество перед окрашиванием суданом///: жир из вакуолей не вымывается, окрашиваются даже самые мелкие капельки липидов.
Приготовление красителя: внести примерно 0,5 г жирового красного (OIL RED) в 100 мл 98% изопропанола (исходный раствор). Для окраски развести 6 мл исходного раствора в 4 мл воды, оставить на 24 часа. Затем раствор фильтруют через бумагу и применяют немедленно. Полученный фильтрат использовать как основной краситель. Порядок проведения окраски: 1. Промыть замороженные срезы в воде и в 60% изопропаноле. Затем окрасить их свежим раствором жирового красного в течение 10 минут. 2. Быстро дифференцировать в 60% изопропаноле (раствор хранить в плотно закрытой посуде или каждый раз готовить свежий). 3. Промыть в воде. 4. Окрасить в гематоксилин-эозине (от 5-10 секунд до 10 минут). 5. Промыть в проточной воде (10 минут). 6. Заключить в гумми-сироп (среда очень густая, ее необходимо предварительно разогреть в термостате; долго сохнет). Результат окрашивания: липиды окрашиваются в красный (оранжевый) цвет, ядра - в синий. Пример окрашивания: Рисунок 4.4.3 - Микрофото. Крупные жировые вакуоли пальцевого мякиша анатомически правильных копытец. Окраска жировым красным (OIL RED) по Лилли. Х-250
