Можно сначала делать гистосрезы из нефиксированных проб тканей, а затем помещать их в фиксирующую жидкость, т.к. без обезвоживания не получится провести окраску срезов.
Если планируется готовить гистосрезы только из рогового чехла копытца или проба тканей содержит роговой слой, то фиксацию проводить не следует, т.к. структура рогового башмака становится еще плотнее и это значительно затрудняет или делает невозможным приготовление гистопрепаратов. Копытцевый рог или пробы тканей, содержащие его, сразу погружаются в специальный раствор для декальцинации, который, как правило, уже содержит формалин, и в свою очередь, препятствует аутолизу мягких тканей.
После фиксации и уплотнения ткани тем или иным способом готовят гистосрезы. Для получения тонких срезов одинаковой толщины, пригодных для микроскопического исследования, пользуются аппаратами - микротомами.
-
Замораживание ткани. При изготовлении гистологических препаратов на кри-
-
отоме применяют жидкую среду: специальный криогель или воду. Этот метод имеет ряд преимуществ:
-
✓ позволяет быстро изготовить гистологические препараты; ✓ различная толщина (от 1 до 150 мкм) гистосрезов;
✓ используется при исследовании тканей на отложение в них жира и жиросодержащих веществ, поскольку жиры растворяются в спиртах, ксилоле и ацетоне (необходимые компоненты при заливке тканей в парафин);
✓ удобно использовать для плотных тканей, например, рогового чехла. При заморозке копытцевого рога или проб тканей, содержащих его, температура в микротоме может быть -10-12°С, т.е. достаточно лишь зафиксировать пробу ткани на столике, дополнительного уплотнения она не требует. При заморозке проб, содержащих жировую ткань, температура микротома должна быть ниже -28-30°С. Это необходимо для дополнительного уплотнения ткани. При более низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится.
лее низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится. Заливка ткани в парафин. Мы использовали стандартные методики, описанные в литературе [2, 3, 4, 5]. Данную методику можно использовать для небольших фрагментов мягких тканей (например, грануляционной ткани). Очень удобны в использовании и значительно ускоряют работу аппараты для проводки и заливки в парафин. Срез должен получиться достаточно тонким и прозрачным, чтобы быть пригодным для окрашивания и микроскопирования. Обычно готовят срезы толщиной от 4 до 15 мкм. Но есть и исключения: • роговой чехол - 2-4 мкм; • мякиш с большим количеством жировой ткани - 20-40 мкм; • срез, включающий ткани различной плотности - 8-10 мкм. Предметные стекла, применяемые для гистологических препаратов, как правило, специально упакованы и уже готовы к использованию. Но иногда гистосрез необходимо дополнительно фиксировать на предметном стекле, например, срезы рогового чехла или срезы, включающие в себя ткани разной плотности. Для этого пользуются одним из способов: ^ стекла окунают в раствор желатина и калиево-хромовых квасцов, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Приготовлениераствора (0,5 л готового раствора): 0,5 л воды, 2 г калиевохромовых квасцов, 2,5-4 г желатина. Калиево-хромовые квасцы растворить в воде, подогретой до 40-50°. Желатин полностью растворить в горячей воде (смотрите инструкцию на упаковке желатина). Смешать оба теплых раствора и обмакнуть в него предметные стекла. Недостаток данного способа: чаще всего происходит окрашивание фона под препаратом. Это затрудняет выделение тканей с совпадающим по тону цветом при использовании компьютерных программ, но, как правило, практически не мешает морфометрии. ^ свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка [2, 3]. Недостаток метода: окрашивание фона под препаратом. ^ готовые адгезивные препараты, которые улучшают прикрепление среза к предметному стеклу, не влияют на реакции окрашивания и не создают фона. Препараты улучшают адгезию также и в методиках, где используется нагревание. К недостаткам можно отнести высокую стоимость препарата.
4.4. Окрашивание гистопрепаратов
Методы окрашивания выбираются, исходя из состава исследуемых тканей и основаны на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям.
Окраска гематоксилин-эозином. Наиболее распространенный метод окрашивания срезов, содержащих любые виды тканей. Этот метод применяется для обзорных исследований, позволяет установить отношения между частями тканей, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Окраска гематоксилин-эозином применяется практически во всех случаях, независимо от поставленной задачи. В большинстве случаев для изучения структуры нормальной или измененной в результате болезни ткани копытец ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда стоит специальная задача, например, выявить виды волокон, пользуются специальными методами окрашивания, но в то же время параллельно окрашивают ряд срезов гематоксилин-эозином. Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры. Замороженные гистосрезы мы окрашивали автоматически на аппарате HMS 70 фирмы MICROM. Порядок проведения окраски: 1. Раствор гематоксилина (5 мин.). 2. Водопроводная вода (1 мин.). 3. Эозин (5 сек.). 4. Водопроводная вода (1 мин.). 5. Дистиллированная вода (30 сек.). 6. Сушка (15 мин.). 7. 96% спирт (5 сек.). 8. Сушка (10 мин.). 9. Ксилол (10 сек.). 10. Сушка (10 мин.). 11. Заключение в бальзам или полистирол. Результат окрашивания: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые. Пример окрашивания:
1 - сосочковый слой; 2 - сетчатый слой
Рисунок 4.4.1 - Микрофото. Основа кожи пальцевого мякиша анатомически правильного копытца. Окраска гематоксилин-эозином. Х-250
