✓ используется при исследовании тканей на отложение в них жира и жиросодержащих веществ, поскольку жиры растворяются в спиртах, ксилоле и ацетоне (необходимые компоненты при заливке тканей в парафин);
✓ удобно использовать для плотных тканей, например, рогового чехла. При заморозке копытцевого рога или проб тканей, содержащих его, температура в микротоме может быть -10-12°С, т.е. достаточно лишь зафиксировать пробу ткани на столике, дополнительного уплотнения она не требует. При заморозке проб, содержащих жировую ткань, температура микротома должна быть ниже -28-30°С. Это необходимо для дополнительного уплотнения ткани. При более низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится.
лее низкой температуре заморозки жировая ткань будет размазываться по ножу, и сделать удачный срез не получится. Заливка ткани в парафин. Мы использовали стандартные методики, описанные в литературе [2, 3, 4, 5]. Данную методику можно использовать для небольших фрагментов мягких тканей (например, грануляционной ткани). Очень удобны в использовании и значительно ускоряют работу аппараты для проводки и заливки в парафин. Срез должен получиться достаточно тонким и прозрачным, чтобы быть пригодным для окрашивания и микроскопирования. Обычно готовят срезы толщиной от 4 до 15 мкм. Но есть и исключения: • роговой чехол - 2-4 мкм; • мякиш с большим количеством жировой ткани - 20-40 мкм; • срез, включающий ткани различной плотности - 8-10 мкм. Предметные стекла, применяемые для гистологических препаратов, как правило, специально упакованы и уже готовы к использованию. Но иногда гистосрез необходимо дополнительно фиксировать на предметном стекле, например, срезы рогового чехла или срезы, включающие в себя ткани разной плотности. Для этого пользуются одним из способов: ^ стекла окунают в раствор желатина и калиево-хромовых квасцов, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Приготовлениераствора (0,5 л готового раствора): 0,5 л воды, 2 г калиевохромовых квасцов, 2,5-4 г желатина. Калиево-хромовые квасцы растворить в воде, подогретой до 40-50°. Желатин полностью растворить в горячей воде (смотрите инструкцию на упаковке желатина). Смешать оба теплых раствора и обмакнуть в него предметные стекла. Недостаток данного способа: чаще всего происходит окрашивание фона под препаратом. Это затрудняет выделение тканей с совпадающим по тону цветом при использовании компьютерных программ, но, как правило, практически не мешает морфометрии. ^ свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка [2, 3]. Недостаток метода: окрашивание фона под препаратом. ^ готовые адгезивные препараты, которые улучшают прикрепление среза к предметному стеклу, не влияют на реакции окрашивания и не создают фона. Препараты улучшают адгезию также и в методиках, где используется нагревание. К недостаткам можно отнести высокую стоимость препарата.
4.4. Окрашивание гистопрепаратов
Методы окрашивания выбираются, исходя из состава исследуемых тканей и основаны на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям.
Окраска гематоксилин-эозином. Наиболее распространенный метод окрашивания срезов, содержащих любые виды тканей. Этот метод применяется для обзорных исследований, позволяет установить отношения между частями тканей, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Окраска гематоксилин-эозином применяется практически во всех случаях, независимо от поставленной задачи. В большинстве случаев для изучения структуры нормальной или измененной в результате болезни ткани копытец ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда стоит специальная задача, например, выявить виды волокон, пользуются специальными методами окрашивания, но в то же время параллельно окрашивают ряд срезов гематоксилин-эозином. Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры. Замороженные гистосрезы мы окрашивали автоматически на аппарате HMS 70 фирмы MICROM. Порядок проведения окраски: 1. Раствор гематоксилина (5 мин.). 2. Водопроводная вода (1 мин.). 3. Эозин (5 сек.). 4. Водопроводная вода (1 мин.). 5. Дистиллированная вода (30 сек.). 6. Сушка (15 мин.). 7. 96% спирт (5 сек.). 8. Сушка (10 мин.). 9. Ксилол (10 сек.). 10. Сушка (10 мин.). 11. Заключение в бальзам или полистирол. Результат окрашивания: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые. Пример окрашивания:
1 - сосочковый слой; 2 - сетчатый слой
Рисунок 4.4.1 - Микрофото. Основа кожи пальцевого мякиша анатомически правильного копытца. Окраска гематоксилин-эозином. Х-250
Гистохимические методы окрашивания основаны на специфическом окрашивании исследуемых тканей определенными красителями. В наших исследованиях мы применяли гистохимические исследования для выявления и подсчета удельной площади коллагеновых и эластических волокон, вакуолей жира.
Окрашивание жиров и липидов. Суть методов заключается в том, что вещества, красящие жиры, хорошо в них растворяются и поэтому легко переходят из раствора в липиды.
Окрашивание Суданом III. Является наиболее распространенным методом
выявления жира.
Приготовление раствора красителя. В 100 мл горячего 70% спирта засы
пают 0,2-0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат
(при 58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.
Порядок проведения окраски:
1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани)
ополоснуть в 50% спирте (30-60 сек.).
2. Поместить в свежеприготовленный раствор судана III на 5-20 мин (бюксы
следует закрывать, так как испарение спирта приводит к выпадению осадков краси
теля).
3. Быстро ополоснуть в 50% спирте (30 сек.).
4. Промыть в водопроводной воде (10-30 мин.).
5. Поместить в гематоксилин (30 сек .-3 мин.).
6. Промыть в водопроводной воде (3-5 мин.).
7. 1% раствор соляно-кислого спирта (3-5 сек.) - если срезы перекрашены!
8. Заключить гистосрезы в желатин, глицерин или глицерин-желатин.
Примечание: препараты сравнительно быстро выцветают, поэтому отклады
вать исследование не рекомендуется.
Результат окрашивания:жировые вещества интенсивно оранжевого цвета, ядра -
синие.
Пример окрашивания:
Рисунок 4.4.2 - Микрофото. Жировые вакуоли подошвенной части пальце
вого мякиша анатомически правильных копытец. Окраска суданом III. Х-
250
РЕПОЗИТОРИЙ УО ВГАВМ
