Пример окрашивания:
Рисунок 4.4.6 - Микрофото. Г иподерма пальцевого мякиша копытца с отросшим рогом. Окраска по Касону. Х-125 Окраска нервной ткани, эластически и коллагеновых волокон, кровеносных сосудов азотнокислым серебром по Рассказовой, в модификации В.В. Малашко (2012 г.). Приготовление серебра: концентрация от 15% до 30%. Например, 15 г серебра на 100 мл бидистиллированной воды, или 5 г серебра на 30 мл бидистиллированной воды. Приготовление кислого формалина: 1% раствор - 10 мл формалина на 100 мл водопроводной воды, или 0,5% - 5 мл формалина на 100 мл воды. Приготовление аммиачного серебра: готовится перед окраской. Титровать азотнокислое серебро до просветления 25% раствором аммиака. Необходимо уловить переход от темной окраски к светлой. Можно добавить 2-3 капли аммиака, чтобы срезы не были слишком темными. Если ткань светлая, то дополнительно аммиак добавлять не нужно. Аммиачная вода: стандартный раствор: к 5 мл 25% аммиака (нашатырный спирт) добавить до 20 мл воды, т.е. соотношение 1:4. Раствор хранить в закрытой банке (запах). Примечание: если срезы перекрашены, то в аммиачной воде они могут потерять окраску и тогда раствор нужно сделать крепче - 10:20; если не докрашены - то раствор аммиачной воды необходимо сделать слабее. Нужно использовать только чистую лабораторную посуду и стеклянную палочку, которая должна храниться в дистиллированной воде и обязательно после формалина ее нужно промывать в отдельном стаканчике с дистиллированной водой. Показатель чистоты - серебро не выпадет в осадок. Если образуется осадок, значит, нарушена чистота лабораторной посуды. Импрегнацию серебром необходимо проводить при температуре в помещении не ниже 200С.
Порядок проведения окраски:
-
Срезы последовательно переносим в нейтральный 10-12% формалин - дистиллированную воду - 960 спирт - 2-3 смены дистиллированной воды. Примечание : если ткань жирная, то в спирте можно держать дольше.
-
Переносим срезы в азотнокислое серебро.
-
Примечание: раствор со срезами можно помещать в термостат (370С) на 30- 60 минут для ускорения имперегнации, но возможно выпадение осадка серебра.
-
Промываем срезы в 2-3 сменах дистиллированной воды. 4. Переносим в 1% раствор формалина (3 чашки. Смену чашки проводить после появления опалесцирующего облачка (помутнения формалина)). После формалина срезы промокнуть фильтровальной бумагой. 5. Аммиачное серебро (10-20 мин.). 6. 0,5% раствор формалина (3 чашки). Примечание: если срезы быстро темнеют, то раствор надо развести до 0,1%. 7. Дистиллированная вода. 8. Аммиачная вода - 10-15 мин. (для просветления срезов). 9. Дистиллированная вода. 10. Спирт 700 - 2-3 секунды. 11. Спирт 960 - 2-3 секунды. 12. Ксилол - 3-5 секунд. 13. Срез заключить в бальзам. Результат окрашивания: на желтовато-коричневом или светлокоричневом фоне черного цвета нервные волокна. Пример окрашивания: Рисунок 4.4.7 - Микрофото. Нервное волокно пальцевого мякиша. Импрегнация азотнокислым серебром по Рассказовой, в модификации В.В. Малашко. Х- 750
4.5. Микроскопия гистопрепаратов 4.5.1. Обзорные исследования
Для обзорных исследований удобно делать срезы, включающие послойно все ткани копытец. Но можно готовить срезы каждого слоя в отдельности, что несколько облегчает изготовление гистопрепаратов, т.к. ткани копытец отличаются по плотности. Обзорные исследования имеют диагностическое значение для выявления патологий копытец, позволяют оценить общую картину состояния тканей, выявить патоморфологические изменения в тканях копытец при отрастании и деформациях копытцевого рога, изучить патогенез ортопедических болезней. Данные исследования включают изучение топографии и строения тканей, их клеточного состава, взаимоотношения структурных компонентов, морфологии заживления патологического очага. В наших исследованиях мы оценивалиформу волокон соединительной ткани (волнистые или распрямленные),структуру и вид слоевэпидермиса (рисунок 4.5.1.1); наличие, количество и вид кровеносных сосудов; количество и форму жировых вакуолей; форму сосочков дермы (правильные и деформированные). 1 - распрямление коллагеновых волокон; 2 - сосочки дермы; 3 - частичное отсутствие базального слоя эпидермиса; 4 - выкрошенный роговой слой эпидермиса Рисунок 4.5.1.1 - Микрофото. Патология дермы и эпидермиса копытец с отросшим рогом. Окраска по Маллори. Х-500 Иногда, при работе с толстыми гистологическими препаратами, не получается изучить структуры на всю глубину тканей из-за невозможности сфокусировать изображение. Мы делали несколько фотографий на разной глубине среза и использовали программу HeliconFocus, которая создает из нескольких частично сфокусированных изображений (рисунок 4.5.1.2), комбинируя сфокусированные области, одно полностью сфокусированное (рисунок 4.5.1.3). Программа создана для макрофотографий и для обработки изображений, полученных с помощью оптических микроскопов, а также решает проблему малой глубины резкости.
