Посл е выдержк и в течени е 5 ми н сперм у разбавляю т фракцие й А ЖЦГ ил и ЦЛЖГ-среды . Сред у приливаю т аккуратн о и медленн о в спермоприемни( кил и п о стенкам стеклянног о смесител я с о спермой ) в оизбежанис еильны хотрицательны хосмотически х явлени .йЭт а н е содержащаг ялицерин а фракци я добавляетс я и з расчет ,а чтобы объем спермы и среды состави л половинз уапланированног о объем а разбавленнос йпермы с( учетом получени в яодном миллилитр е20 0миллионос вперматозоидов .)Температурс апермыс и реды – 30°C . Предварительн о разбавленна я фракцие й А сперм а помещаетс я в холодильни к иохлаждаетст в яечени е 2 чд о5 � С .Длт яог очтобы охлаждени е проходил о равномерн ,о колб у с разбавленно й спермо й помещаю т в стака н с водо ,й температур а которо й – 30°C . Фракцию Б среды , содержащую глицери ,н такж е помещают в холодильни ,к гд е он а охлаждаетс я д о момент а использовани .я Эт а фракци я може т содержат ь5–10% концентрациа интибиотико ,вопределенно йдл яфракци иА . Чере ч 2 значинаетсв ятороэ йтар пазбавленис япермы .В предварительн оразбавленную фракцие йАс перм увнося тохлажденнуюг лиц-е риновую фракцию Бс в оотношени и к .е .т ,1:1одном уобъем уразбавленнос йпермы прибавляю травны йобъем охлажденно( йд о5°Cс )р-е ды .Фракцию Бв нося тнс еразд а ,уеля тнт арр иавныч еаст и иприбавляю т чере з 10–15-минутны е интервалы медленн о и постепенн .о Это т эта празбавлени я производитс я в холодильник епрт иемператур е5°C н апротяжени и30–4 5ми .нПосл ефинальног оразбавлени я в 1м лра-з бавленнос йпермыд олжнс оодержатьс1 я0 0млс .нперматозоидо.в Посл е завершени я разбавлени я сперм у расфасовываю т в пайеты , которы еразмещаю в тпланшеты .В каждо йпайет едолжнс оодержатьс2 я 5млс .нперматозоидо.в Есл ирасфасовываюс тпермг в уранула( х 2,0млт ,)огд апосл ефинальног оразбавлени яфракцие йБ в 1мс лпермы должнс оодержатьс я 12 5млс .нперматозоидо.в Дл ядостижени я выравнивани яконцентрациг илицерин с анаружно й и внутренне й сторо н клеточно й мембраны достаточн о 4 ( чврем я эквилибрации .)Вт ечениэ етог овремен иокончательн оразбавленную спермв уыдерживаю тпрт иемператур е5°Cз а ,атемз амораживаю тп о стандартнот йехнологи .и Сперм убык аразбавляю с трасчетом получени я1 0– 1 5млс .нперматозоидо в с прямолинейно-поступательным движением пр и подвижност и н е мене е 4 балло .в Дл я расчет а степен и разбавлени я и-с пользую тформулу
С � А � V
Р = --------------- ,
0,01 0 � 1 0
гд еР – количествр оазбавителд ял 1 ямс лпермы; С – концентрацис яперматозоидос в вперм ,емлр .дм;л А – подвижностс ьперматозоидоп вослр еазмораживани( яб 4алл;)а V – объемд озыс пермы ,м.л 0,01 0– подвижны хсперматозоидод в воз ,емлр.д 1 0– перевоб далло( в4к в )оличествп оодвижныс хперматозоидо.в Разбавленис епермыб аранк и аозла . Посл е получени я сперм у постепенн оохлаждаю тд о25–30 � С .В момен тразбавленис яперм ас ир-е д а должны имет ь одинаковую температур .у Разбавляю т сперм у в спермоприемник .е Н а 1 м л спермы добавляю т 1– 2 м л среды . Охлаждаю тразбавленнуюс перм упостепенн од о2–4 � Ст в ечени е2– 3 .чЖ-е лательн офлаконыс с опермо йпоместит в ьхимическис йтакав с нодо й температуры2 5–30 � Сп и оместитх в ьолодильни кнч 2 аас.а Пр и использовани и сре д длз яамораживани я и длительног о хран-е ни япосл еполученис яперм увыдерживаю тн еболе е1 5ми .нСредо й ВИКА разбавляю в тоди нприемс в оотношени и 2:1прк ионцентраци и сперматозоидо в 5,2– 3,3 млр .д в м л и 3:1 пр и концентраци и и х выш е 3,3 млр .д в м .л Средт( уемпературы 30 � С ) добавляю т в сперм у осторожнп ос отенкамс пермоприемник.а Пр и использовани и ЛЖГТЦГ-среды сперм у разбавляю т в дв а прием :а сначал а ЛЖ-средо й в соотношени и 5,0:1 пр и температур е 28 � 2 � Сз а ,атем добавляю тоди нобъем ЛЖГТЦГ-среды прт иемп-е ратур2 е0 � 2 � С . ГЖУК- трис-буфернос йредос йвежеполученнуюс перм уразбавляю в тоди нприемс в оотношени и 3:1прк ионцентрацис иперматозоидо3 в– 4млр в .дмп 4:1 и лрк ионцентрации ис хвыш 4 емлр в .дм.л Спермк уозла разбавляю5 в т–2р 0а .зИо здногэ оякулят аможн ополучит ьд4 од 0о в а ,знеделюо о тдногс оамцв ав орем яполовогс оезон а– д3 о0д 0о.з Разбавленис епермых ряка .Посл еполученис япермв уыдерживаю т т вечени2 е0–3 0ми нпрк иомнатнот йемператур ер иазбавляю т2 в–1 0 ра .зВ неразбавленнос йперм едолжнс оодержатьс ян е мене е10 0мл .н сперматозоидо ,вподвижност ь– н ениж е 7балло .вВ одно йдоз еобъемом1 0 0мд лолжнб оыт 5,2 ьмлрп .додвижныс хперматозоидо.в Приме ррасчетк аоличеств адо зк иоличеств аразбавител .яПроцен т сперматозоидо в с нормально й подвижностью – 70%( 7,0 ,) концентр-а ци я– 13 4миллион 1 в ам ,лмассэ аякулят а– 23 .г 3 Количествд оо з– 231,0 · 33 5,2 : 7,0 · 4=д 8 о .з 1 · 80 0– 23 3=5 6 7мр лазбавител.я Разбавленис епермы жеребца .Разбавляю тсперме ,услк ионцентр-а цис яперматозоидо вн емене е15 0мл в .нм л иподвижност ьн ениж е 6 балло .в Степен ь разбавлени я – 2:1 – .3:1 Сред у приливаю т к сперм е
небольшим ипорциям и иосторожнс омешиваю тпосл едобавлени як-а ждо йпорцис иреды .
Разбавленис епермы птиц .Оплодотворяющас япособностс ьвеж-е полученно й спермы пти ц сохраняетс я недолг .о Сперм у петухо в и индюко вможн оиспользоватт в ьечени3 е 0мич а ,.нтобыо беспечитс ьт-а бильн о высоки е результаты выводимост и цыпля т и индюша ,т е е и-с пользуют в течени1 е5–2 0ми .нПослр еазбавленис яперм уможнх ор-а нит ь д о 2– 3 .ч Дл я разбавлени я использую т нескольк о срет( даб .л 3 .) Разбавляюс тперм 1:1 у– .3:1
| Т а б л и ц а .3 С о с т а в с р е д д | л я р а з б а в л е н | и я с п е р м ы | п т и ц |
|---|---|---|---|
| Н а и м е н о в а н и е р е а к т и в а | В И Р Г Ж -2 | Л е й к а | Т и р о д е |
| Н а т р и я х л о р и д | – | – | 8,0 |
| К а л и я х л о р и д | – | – | 0,0 2 |
| К а л ь ц и я х л о р и д | – | – | 0,0 2 |
| М а г н и я х л о р и д | – | 0,0 6 7 6 | 0,0 1 |
| Н а т р и я а ц е т а т | – | 6,0 1 3 | 1,0 |
| Н а т р и й д в у з а м е щ е н н ы й ф о -с | |||
| ф о р н о к и с л ы й | – | – | 0,0 0 5 |
| К а л и я ц и т р а т | – | 1,0 2 8 | – |
| Н а т р и й г л у т а м и н о в о к и с л ы й | 8,2 | 9,1 2 | – |
| Ф р у к т о з а | – | 0,1 | 0,1 |
| Г л ю к о з а | 8,1 | – | – |
| Д и с т и л л и р о в а н н а я в о д а | 1 0 0 м л | 1 0 0 м л | 1 0 0 м л |
.3.6Контроло ьсмотическогд оавлени яи рНс ред дл яразбавленис япермы
Осмотическо е давлени е определяю т методом криоскопи ,и рНпотенциометрическим методом с помощьюс оответствующег оприбор .а
Криоско п имеев тнутреннюю пробирк( уцилинд рн а10 0м лбе зо-с новани ,я с плоским дном ,) в которую вставляетс я резинова я пробк .а Пробк а имее т центрально е отверсти е дл я термометр а Бекман а и н-е большо е отверсти е в боково й част и с металлическо й втулко ,й чере з которую проходи т проволочна я мешалк ;а в процесс е работы втулк у смазываю ткапелько ймашинног омасл .аВнутрення япробиркт с аермометром Бекман а имешалков йставляетс в яболе еширокую пробирк( уцилинд рн2 а5 0мб лео зсновани с ,яплоскимд ном )у икрепляетс в я не й посредством широког о (4– 5 см ) толстог о резиновог о манжет .а Широка япробиркс алужи твоздушно йрубашко йдл явнутренне йпробирк .иСобранны йприбо рпогружаю тчере зотверсти е вкрышк с ер-е зиново йвтулко йт волстостенныс йтака( нвысот а20 0мм ,внутренни й диамет р 115–12 0 мм .) Предварительн о стаказ наполняю т охладитель-
