по принципу парных аналогов были сформированы три группы коров: две опытные – с клиническим и субклиническим маститами и одна контрольная – клинически здоровые коровы. В ходе опыта у этих животных отбирали кровь для гематологических, биохимических и иммунологических исследований.
Гематологические и биохимические показатели крови определяли с помощью анализаторов Medonic CA 620 и Dialab Autolyser 20010 D с использованием диагностического набора реактивов фирмы CORMAY (Poland).
Количество общего белка определяли методом постановки биуретовой реакции. Он основан на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Интенсивность образовавшейся окраски прямо пропорциональна количеству пептидных связей, и тем самым, концентрации белка. Оптическую плотность измеряли при длине волны 540 нм. Содержание белка в исследуемом растворе рассчитывали по калибровочному графику.
Концентрацию альбумина в сыворотке крови определяли по реакции с бромкрезоловым зеленым, который в слабокислой среде в присутствии детергента образует с альбумином окрашенный комплекс синего цвета. Интенсивность окраски измеряли при длине волны 690 нм.
Для контроля естественной резистентности подопытных животных исследовали концентрацию иммуноглобулинов A, G, M в сыворотке крови турбидиметрическим методом с использованием диагностического набора «Dialab». Бактерицидную активность сыворотки крови исследовали методом, предложенным Мюнселем и Трефенсом в модификации О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1975) с кишечной палочкой [174].
Лизоцимную активность сыворотки крови определяли методом, описанным А.Г. Дорофейчиком (1968). В качестве тест-культуры использовали Micrococcus lysodeiticus [174].
Фагоцитарную активность лейкоцитов крови определяли по методике Е.А. Кост и М.И. Стенко (1975) [174].
Компоненты для конструирования противомаститного препарата подбирали с учетом их физической, химической и фармакологической совместимости [233].
Чувствительность выделенной от коров, больных маститом, микрофлоры к разработанному препарату «Белмаст» определяли лунко-диффузным методом. В стерильные бактериологические чашки (чашки Петри) наливали по 20 см3 расплавленной агаровой среды. На поверхность застывшей среды наносили 1 см3 бактериальной взвеси испытуемой культуры (предварительно стандартизированной до концентрации 1:100000 по стандарту мутности). В некоторых случаях засевали непосредственно молоком (секретом) из пораженной четверти вымени. Далее чашку ставили в термостат (+37ºС) на 30 минут. После этого на поверхности засеянной среды делали металлическим лункорезом луночки, в которые вносили разработанный препарат. Чашки выдерживали 2-3 часа при комнатной температуре и в течение 16-18 часов в термостате при температуре +37ºС. Оценку результатов проводили с помощью линейки, которой определяли диаметр зоны задержки роста микроорганизмов вокруг лунки.
Исследования по определению антибактериальной активности разрабатываемого препарата «Белмаст» в процессе хранения проводили по модифицированной методике. В чашки Петри заливали 15 см3 4%-ного МПА, оставляли для застывания агара на 30-40 мин; затем на поверхность застывшего агара заливали 10 см3 1,2-1,6% (мягкого) мясопептонного агара, содержащего бактериальную взвесь патогенного микроорганизма (тест-штамма). После нанесения 1,2%-ного агара с тест-организмом на плотный агар чашки на 30 мин оставляли для застывания, затем стерильным металлическим пробойником делали луночки в агаре на расстоянии 2 см от края чашки (по 4 лунки в каждой чашке), после чего в лунки вносили испытуемый препарат в количестве 0,1 см3 . В таком виде чашки
выдерживали в течение 2 часов при комнатной температуре, затем помещали в термостат при +37ºС. Результат учитывали через 24 часа.
Изучение раздражающих и токсикологических свойств разрабатываемого препарата проведено согласно «Методическим указаниям по токсикологической оценке химических веществ и фармакологических препаратов, применяемых в ветеринарии» [42].
Для определения острой токсичности препарата «Белмаст» провели опыт на 20 белых крысах живой массой 195,0±5,0 г. В предварительном опыте на 6 животных определяли предельно переносимую дозу препарата. Для этого по принципу аналогов сформировали 2 группы (опытная и контрольная) животных по три головы в каждой. Животным опытной группы вводили препарат «Белмаст» в максимальной дозе (5,0 см3 ) внутрижелудочно при помощи шприца с металлическим зондом. Поение и кормление проводили не ранее, чем через 3 часа после дачи препарата. Крысы контрольной группы получали изотонический раствор натрия хлорида в дозе 5,0 см3 . Наблюдение за животными вели в течение 14 дней, учитывая общее состояние, поведение, прием корма и воды, регистрируя сроки их гибели. В ходе предварительного опыта установлено, что при однократном внутрижелудочном введении белым крысам препарата в максимально возможной дозе (5,0 см3 ) падежа не отмечено. Животные не имели отклонений в клиническом состоянии, адекватно реагировали на внешние раздражители, охотно принимали корм и воду. Изменений со стороны кожного, волосяного покрова и цвета слизистых оболочек у животных не отмечено. Исходя из этого, основной опыт по определению острой токсичности проводили методом «тест накопления», т.е. препарат вводили в дозе 5,0 см3 трехкратно с интервалом 2 часа. По принципу аналогов сформировали 2 группы (опытная и контрольная) белых крыс по 7 голов в каждой. Препарат вводили животным опытной группы внутрижелудочно при помощи шприца с металлическим
