Росту и развитию большого количества разнообразной по составу микрофлоры и микрофауны способствуют определенные благоприятные условия среды в рубце, в том числе рН содержимого, постоянный ионный состав, непрерывное снабжение микроорганизмов питательной средой (кормом), анаэробные условия.
Бактерии и простейшие очень тесно реагируют на изменения кормления и содержания животных. Например, количество инфузорий увеличивается при добавке к рациону достаточного количества сена, углеводистых кормов. Если же в рационе преобладает силос, количество простейших уменьшается, изменяется их видовой состав. Летом при кормлении зелеными кормами их, как правило, становится больше по сравнению с зимним рационом. Почти полностью они исчезают при голодании, патологическом состоянии преджелудков, атонии, тимпании рубца, травматическом ретикулоперитоните.
Определение количества инфузорий. В рубце у жвачных находится примерно 100 видов инфузорий. Преимущественно они представлены классом Ciliata, в который входят две большие группы: подкласс Holotricha и подкласс Spirotricha. Инфузории первой группы равнореснитчатые (вся их поверхность равномерно покрыта ресничками). Подкласс Spirotricha (малореснитчатые) в рубце составляет 60-80 % общего количества инфузорий.
Наличие в рубце большого количества инфузорий свидетельствует о нормальном и эффективном течении ферментативных процессов. Наиболее чувствительны к изменениям среды рубца большие инфузории. При неблагоприятных условиях существования в рубце они исчезают в первую очередь и появляются при нормализации процессов последними.
Видовой состав простейших определяют только в свежем содержимом рубца. Для этого каплю его наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают по микроскопом вначале при малом (окуляр х7, объектив х10), затем при большом (окуляр х7, объектив х40) увеличении в слегка затемненном поле зрения. Поскольку инфузории, особенно большие, при комнатной температуре быстро теряют подвижность, то можно пользоваться столиком с подогревом (температура 38-39 °С). Для более детального определения строения инфузорий препарат лучше покрасить раствором Люголя или приготовить мазок и рассматривать его при большом увеличении или под иммерсией.
Реактив: 0,85%-ный раствор NaCl, слегка окрашенный метиленовым синим.
Оборудование: микроскоп; счетная камера с сеткой Горяева; лейкоцитарный меланжер.
Ход определения. В пробирку отбирают 5 мл профильтрованного содержимого рубца (жидкую часть) и добавляют 0,1 мл 4%ного раствора формалина для фиксации инфузорий. Это позволяет подсчитывать количество инфузорий в течение 20—24 ч после взятия содержимого рубца. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, набирают жидкость в лейкоцитарный смеситель (меланжер) до метки 1, а до метки 11 - изотонический раствор натрия хлорида, предварительно окрашенный раствором метиленового синего. Встряхивают 1-2 мин и получают разведение пробы в 10 раз.
В камеру с сеткой Горяева под покровное стекло вносят 1 каплю жидкости (первую каплю выдувают на вату). Инфузории подсчитывают в 100 больших квадратах. Общее количество инфузорий в 1 мм3 (1 мкл) определяют по формуле
х = AC/nSh,r. е. х = А*25,
где х — количество инфузорий в 1 мм3 (1 мкл); А — количество подсчитанных инфузорий; С — разведение пробы; и — количество квадратов, в которых подсчитывали инфузории (100); S— площадь одного квадрата (1/25); h — высота камеры (0,1).
Количество инфузорий в 1 мл содержимого рубца определяют по формуле х = А *1000, ибо 1 мл = 1000 мкл.
В 1 мл жидкости рубца находится от 500 тыс. до 1,2 млн инфузорий. Количество их уменьшается при различных патологиях. Особенно мало инфузорий (70—100 тыс/мл) при смещении сычуга (А. В. Чуб, 2002).
Подсчет бактерий. Бактерии играют важную роль в процессах пищеварения жвачных животных. Они подвергают ферментному расщеплению целлюлозу (основной компонент грубых кормов), крахмал, моносахариды, кислоты (молочную, янтарную, муравьиную), липиды, принимают участие в превращении азотистых соединений. Наряду с основными видами существует ряд бактерий, которые не имеют функционального значения в рубцовом пищеварении, а попадают в рубец с кормом и водой.
Чисто рубцовые бактерии должны отвечать определенным требованиям:
1) выделенные из рубца микроорганизмы должны быть анаэробными;
2) бактерии должны присутствовать в рубце в количестве не менее чем 1 млн в 1 мл содержимого;
3) по 10 штаммов данного вида бактерий должно быть выделено не менее чем от двух животных;
4) культуры данного вида бактерий должны присутствовать в рубце животных различных географических зон;
5) конечные продукты обмена веществ полученных культур микроорганизмов должны быть типичными рубцовыми метаболитами. В 1 мл рубцового содержимого присутствует 109 —1010 бактерий. Реактив: 0,85%-ный раствор NaCl.
Оборудование: микроскоп; микропипетки.
Ход определения. Содержимое рубца разводят стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:1000. Микропипеткой отбирают 0,01 мл этого разведения и профламбированной петлей размазывают его на предметном стекле на площади 1 см2 . Как правило, делают 3-4 мазка. Мазок высушивают над пламенем спиртовки и красят по Грамму. Готовый мазок исследуют под иммерсией. Подсчитывают бактерии в определенном количестве типичных полей зрения. В связи с тем что мазок не всегда получается равномерным, поля зрения для подсчета необходимо брать по всему мазку, а лучше по диагонали. В каждом мазке подсчитывают не менее 10 полей зрения и выводят среднее значение для одного поля.
Чтобы определить общее количество бактерий всего мазка, уточняют площадь поля зрения микроскопа. Так как площадь круга составляет %г, то необходимо измерить диаметр поля (в мм) с помощью объект-микрометра. Площадь мазка 100 мм2 , деленная на площадь поля зрения под микроскопом, равна количеству полей зрения в мазке. Поскольку мазок приготовлен из 0,01 мл жидкости, то количество полей зрения в мазке, умноженное на 100, дает количество полей зрения в 1 мл рубцовой жидкости, разведенной до 103 (1:1000). Все эти арифметические подсчеты можно объединить формулой 10000 : 3,1417 * г2 , где 3,1417 — коэффициент, на который следует умножить среднее количество клеток в поле зрения микроскопа.
Таким образом, подсчитав необходимое количество полей зрения (по 10 в трех мазках), суммируют общее количество бактерий и вычисляют среднее количество бактерий в одном поле зрения. Полученное число умножают на коэффициент и степень разведения. Коэффициент остается постоянным до тех пор, пока объектив, положение тубуса и окуляр микроскопа не меняются.
Пример. Определяем коэффициент. Диаметр поля зрения микроскопа 0,132 мм, соответственно его радиус — 0,066 мм, а г составляет 0,004356:
