1991). Первоначально был сиквинирован ген ВоГ.А-ОВВ1, затем BoLA-DRB2 и позднее ген ВоГА-ОВВ из клана Al, предположительно являющийся аллельным вариантом BoLA-DRB3. Сходство экзонов 2, 3 и 4 гена ОВВЗ с теми же участками ОВВ1, DRB2 и Al составляют 83,1: 86,3 и 6,8% соответственно. Последовательность 61 экзона DRB3 сходна с bl экзонами гена DRB1 на 72,1%, DRB2 на 74,8% и А] - на 93,6%.
Для изучения ГКГС у крупного рогатого скота помимо ПДРФ-анализа применен ПЦР (полимеразная цепная реакция). Как и в случае НГА, исследование методом ПЦР стало возможным после определения нуклеотидной последовательности генов BoLA. В настоящее время сиквинирована большая часть экзонов и участков интронов ВоГ.А ООВ гена; кроме того экзоны 2, 3 и 4, а также части последовательностей между ними генов ОКА и DQA, частично секвенированы последовательности BoLA-DIB (помимо уже перечисленных DRB1, DRB2 и DRB3).
Метод полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием применен для изучения полиморфизма экзона, кодирующего первый наиболее полиморфный домен ВоГА-ОВВ. Первоначально использовали образцы ДНК четырнадцати различных вариантов гаплотипов класса II, определенных с помощью ПДРФ-анализа. В результате выявили 14 аллелей в одном локусе DRB3. Отличие в последовательностях разных аллелей при попарном сравнении выявили от 5 до 21 аминокислотных замен из 83 сравниваемых положений. Кроме того, изучение второго экзона этим методом проведено у африканских пород крупного рогатого скота (включая зебу), в результате чего обнаружено 8 новых аллелей (S.Johansson, L.Andersson, 1992). В дальнейшем проведено изучение полиморфизма гена DRB3 методом ПЦР в сочетании с последующим рестрикционным анализом, приведшее к определению более 30 аллелей.
Генетическое разнообразие на аминокислотном уровне, обнаруженное у крупного рогатого скота для продуктов гена DRB3, сходно с ранее установленным для локуса НГА-ОКВВ1. Как в случае генов класса П НГА, выявлено значительное превышение значимых нуклеотидных замен над "молчащими" в экзоне, коди-
рующим первый домен ВоГ.А-ОВВЗ, что предполагает действие отбора, способствующего генетическому разнообразию молекул. Сравнение полиморфизма локуса DRBу человека и крупного рогатого скота показывает поразительное сходство в расположении полиморфных участков и степени их полиморфности. Повидимому, большая часть полиморфных положений принадлежит сайту узнавания молекул класса II. Кроме этого отмечено 8 совпадающих полиморфных положений в молекуле DRB человека и крупного рогатого скота, лежащих, вероятно, за пределами сайта узнавания.
Нами, совместно с Институтом общей генетики РАН, был проведен анализ полиморфизма b-1 домена DRB и промоторного участка (5 область) гена ООВ у крупного рогатого скота холмогорской, черно-пестрой, герефордской пород и зубров. Применялся метод полимерной цепной реакции (ПЦР) в сочетаниис рестрикционным анализом отдельных фрагментов .
По методу ПЦР было тестировано 18 фрагментов разной длины. Кроме того, часть образцов ДНК не давала амплификации (0-вариант). Каждый из амплифицированных фрагментов характеризует аллельный вариант гена. Наибольшее количество вариантов гена DRB выявлено в холмогорской породе (12 аллелей), причем копии гена представлены фрагментами разной длины, частоты которых варьируют от 0,09 до 1,00 ( табл. 7). У чернопестрой породы выявлено 7 аллелей, которые представлены в данной группе животных с высокой частотой (не менее 0,45) и два из них характерны только для этой группы и, по-видимому, могут служить её породными маркерами. Крайне ограниченное число аллелей у исследованных групп герефордской породы и зубров (3 и 2 аллеля соответственно). У герефордских животных найдены, встречающиеся только у них, два фрагмента (180 и 199 п.н.). Фрагменты, обнаруженные у зубров (220 и 141 п.н.), имеются и у пород молочного скота.
Полученные фрагменты распределяются на несколько типов: присущие только одной породе, общие для всех изученных пород, общие для двух пород и зубров. При этом надо отметить, что выборка не вполне достаточна, т.к. в большинстве случаев колиЧество животных не велико (холмогорских — 60, черно-пестрых —
| Таблица 7. | Основные по | продукты С. С. | Соколовойи | амплификации Г. Е | Сулимовой, | b-1 домена 1993 | гена | DRB |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Размер | порода | Черно-пестрая порода | ская | Гетерофорд- порода | Зубры | |||
| фрагмента | | п | | частота | | п | | частота | | п | | частота | [п | | частота |
| 300TT | 29 | ПОЗЕ | ЗИПОЗ | |||||
| [316-320 278-280 {| | 9 | | 0166 | | 38 | | 0809 | ЗИОЗ | ПОЗ ОЗ| | ПО ~ | |
| [16 | | 0296 | | 38 | [0,809 | | - | | - | | - | | - | |
| рю | [0296 | | | ||||||
| в | ||||||||
| [240 216-220 | | 16 [ | | 0296 02% | TO | 0,809 | | - | | = [ | - | [- |
| [ 9 | [0,166 | [21 | [0,446 | | - | | - | [ШТ | 0,785 | |
| [06 | [0296 | р | ||||||
| р | ра | 02 | || | |||||
| рб | 03 | |. | | - | |||||
| 606Г | 0,296 | [р | ||||||
| в п | oo [0,296 | | - | | - | [р [- | f - | - | fp - | |
| 54 | | 100 | [47 [ | 1,000 | | 18 | [| 10 | | 14 | | 100 | |
| ПЕ | ПЕНИ | ГУС 4 [| | - | ПО tooo | ОРЗ ПОЗ | ПОЗ ПОЗА | ПОЗ ПЕН | ООО ПО |
| 0.487 [| | - | [| - [ | - | f - f | - | y | ||
| ор | ||||||||
| [| | 039 | ooo | ||. | - | ||||
| Г Примечание: | 4^ - | средняя [00| | |[01 аллельная | [09| | частота; (1-4^) | [| - | среднее 0,56 [044 | | | | значение | [0,891 0.109 гетерози- |
готности.
Отдельные амплифицированные фрагменты присутствуют У исследуемых животных одновременно, составляя устойчивые сочетания (варианты), определяющие генотип животных по данному локусу (табл. 8). Максимальное количество продуктов амплификации разной длины, полученных из одного образца ДНК было равно 12-ти, что свидетельствует о возможности присутствия шести копий гена на гаплоидный геном. Среднее значение гетерозиготности у животных черно-пестрой породы оказалось очень низким (0,189), так же как у зубров (0.109). У животных холмогорской породы значение гетерозиготности несколько выше, чем у герефордов (0,631 и 0,484 соответственно). При оценке полу-
