творяю тнавескз ,уатем добавляюв тоды д ометк .иРаство рперелив-а юк в толбд улс ятерилизаци .иКолбз уакрываю тпергаментноб йумаго й ипомещаюа в твтокла .вВыдерживаюа в твтоклавт в еечени е3 0ми н пр и давлени и 2,0 атм . Допускаетс я стерилизаци я в кипяще й водяно й бант в еечени1 е 0ми .н Можн о стерилизоват ь буфе р и путем филь-т рацие иг очере змембранны йфильт с рвеличино йпо р4,0 5мкм с вт-е рильную посуд .у Посл е стерилизаци и раство р долже н имет ь осмотическо е давлени е 285–30 0 mOsm s и рН 8,6– .9,6 Храня т в течени е 1– 2 неделп ьр5 и � Сд и оспользовани.я Дл яприготовлени я молочнос йреды используюс твеже еил ипаст-е ризованно ,е гомогенизированно е цельно е молок о жирностью окол о 5,3%( илг иомогенизированны е сливк и + обра т и з расчет а получени я смес ,ижирностью5,3 % .)Тако емолокс оодержив тредныд елс яперм-а тозоидоэ внзимы , н о пр и нагревани и ег о т вечени е 1 0 мину т пр и 92– 95 � Со нр иазрушаютс .яПрогреваю тмолокз в оакрытомд войномс теклянном бойлер еил и вводяно йбан ;езатем охлаждаю тд о комнатно й температуры . Переливаю т охлажденно е молок о в стерильную колб ,у оставля я пен у в бойлер е ил и пр и необходимост и фильтрую т чере з стерильны й фильт .р Разделяю т н а дв е фракци .и Пр и использовани и гомогенизированны х сливо к и обрат а посл е стерилизаци и и охлажд-е нис ямес к ине йприливаюс ттерильныр йаство рфруктозы д иистиллированную водз а ,уатем разделяю т н адв ефракци .иВ фракцию А молочныс хре ддобавляюа тнтибиотик ,и вфракцию Б – глицери .нПервую фракцию оставляю тпрт иемператур е323...5 � С а ,фракцию Б охлаждаюд тт оемпературы4 � С . Пр и приготовлени и среды ВИКА дл я спермы барана токоферо л може т быт ь замене н 0,0 5 г ди-трет-бутил-крезолом( ДТБК .) Раство р сахарозы и натрий-кальциевую сол ь ЭДТА стерилизую т в водяно й бан е в течени е 1 5 ми .н Желто к эмульгирую т с токоферолом в ст-е рильном мерномс такан в еводяно йбан епрт иемператур е37 � С т в-е чени е 5– 7 ми ,н постоянн о помешива я стеклянно й палочко( йудобне е пользоватьс ямагнитно ймешалкойЗ .)атемэ в тос ттакав ннося тпосл-е довательнс отерильныр йаствос рахарозыс с олью ЭДТАс ,пермосан- 3 г илицери .нТехник априготовлени яЛЖГТЦГ-среды болес еложна ,я чт о обусловлен о требованиям и длительно й стерилизаци и в водяно й бан( е3 0 ми н дл я ЛЖ-среды и 6 0 мину т дл я ЛЖГТЦГ-среды ) все х компоненто ,вкром ежелтк ас ипермосан ,аконтрол яиспаренив яоды в процесс е стерилизаци и путем взвешивани я колбы с содержимым и восполненив яоды прз иначительные хп еотеря.х Технологи яразбавленис япермы зависи тос твойст вс иоставс ар-е ды . Пр и использовани и однофракционны х сред признанную годно й посл е предварительно й оценк и сперм у бык а вначал е разбавляю т 1:1 непосредственнс в опермоприемник ;епере дразбавлениемт емперату-
рс ареды с ипермыд олжнб аыто ьдинаково( й27 � 1 � С .)Длэ ятог опосуд у с о средо й храня т в термостат е ил и н а подогреваемо й магнитно й мешалк .е Чере з 15–2 0 ми н посл е предварительног о разбавлени я проводя т финально е разбавлени е пр и температур е 18–20 � С . Разбавляю т спермт уач ,ктобы в дозс епермы посло еттаиванис яодержалос1 ь0–1 5 млп .нодвижныс хперматозоидо.в Пр и разбавлени и использую т шпри ц непрерывног о действи .я Ра-з бавляю т сперм у средо й постепенн .о Дл я этог о сред у приливаю т к предварительн о разбавленно й сперм е небольшим и порциям и в полиэтиленовы й спермоприемни ,к осторожн о смешиваю т посл е добавл-е ник яаждо йпорции среды . Пр и использовани и градуированног о смесител я разбавленную в спермоприемник ес 1:1перм убык апереливаю т с вмесител ь инебольшим ипорциям ипс отенкд еобавляюс тред .уПослд еобавленик яаждо й порци и смесител ь наклоняют та ,к чтобы сперм а оставалас ь вниз у ег о расширенноч йастив ;ращас ямесителс ,ьмешиваюс тперм .у Современны е технологи и предусматриваю т автоматизированно е разбавленис епермык с онтролемт емпературы в иыборомс тепенр иа-з бавлени я с учетом подвижност и и концентраци и сперматозоидо в в сперм,е т аакжк еоличеств аподвижныс хперматозоидод в воз( епайет )е дло ясеменени .я Пр и использовани и двухфракционны х сре д ЖЦГ и ЦЛЖГ пере д разбавлением спермы буфе р подогреваю т д о 33...25 � С , разделяю т н а дв е фракци ,и добавляю т в каждую и з ни х необходимо е количеств о желтк аг илицерин( а вфракцию Б .)В фракцию Ав нося ти зрасчет ан а кажды й миллилит р среды 10 0 мк г тилозин ,а 50 0 мкг гентамицин а и 306/00 0мкл гинкоспектинр ,аастворенны0,0 в х 2мб лидистиллированно й стерильно й воды . Весовы е количеств а антибиотико в необходим о приводит ь в соответстви е с и х активностью , котора я може т различатьс я з вависимост и о т парти и препарат .а Вс е антибиотик и должны быт ьпроверены нб аезвредностд ьлс яперматозоидо .вГентомици н и о тилози н могу т сохранятьс я в раствор е пр и 5 С т вечени е 8 дне ,й а в пара хжидкога озот а– д 6 омесяце.в Сначал аи зполученног оо ицененног опв онешнимс войствамэ якулят а беру т пробы дл я определени я подвижност и и концентраци и сперматозоидо в в сперм .е Есл и эякуля т пригоде н дл я использовани ,я т о проводитс я санаци я неразбавленно й спермы . В спермоприемни к внося т пипеточным дозатором смес ь антибиотико .в Н а кажды й миллилит р спермы добавляю т 0,0 2м л раствор ,а в котором содержитс я 10 0мкт гилозин ,а50 0мкг гентамицин а и306/00 0мк глинкоспектин .а Посл еосторожногс омешиванис япермв уыдерживаю т 5ми нпрт иемператур3 е0 � Сз ,атеме о ецениваю тпп оодвижностс иперматозоидо .в Есл ииспользуетс яполигет ,но ов нноситс в янеобходимык холич-е ствао в хб ефракцис ирес в а ,дпермн уд еобавляетс.я
Посл е выдержк и в течени е 5 ми н сперм у разбавляю т фракцие й А ЖЦГ ил и ЦЛЖГ-среды . Сред у приливаю т аккуратн о и медленн о в спермоприемни( кил и п о стенкам стеклянног о смесител я с о спермой ) в оизбежанис еильны хотрицательны хосмотически х явлени .йЭт а н е содержащаг ялицерин а фракци я добавляетс я и з расчет ,а чтобы объем спермы и среды состави л половинз уапланированног о объем а разбавленнос йпермы с( учетом получени в яодном миллилитр е20 0миллионос вперматозоидов .)Температурс апермыс и реды – 30°C . Предварительн о разбавленна я фракцие й А сперм а помещаетс я в холодильни к иохлаждаетст в яечени е 2 чд о5 � С .Длт яог очтобы охлаждени е проходил о равномерн ,о колб у с разбавленно й спермо й помещаю т в стака н с водо ,й температур а которо й – 30°C . Фракцию Б среды , содержащую глицери ,н такж е помещают в холодильни ,к гд е он а охлаждаетс я д о момент а использовани .я Эт а фракци я може т содержат ь5–10% концентрациа интибиотико ,вопределенно йдл яфракци иА . Чере ч 2 значинаетсв ятороэ йтар пазбавленис япермы .В предварительн оразбавленную фракцие йАс перм увнося тохлажденнуюг лиц-е риновую фракцию Бс в оотношени и к .е .т ,1:1одном уобъем уразбавленнос йпермы прибавляю травны йобъем охлажденно( йд о5°Cс )р-е ды .Фракцию Бв нося тнс еразд а ,уеля тнт арр иавныч еаст и иприбавляю т чере з 10–15-минутны е интервалы медленн о и постепенн .о Это т эта празбавлени я производитс я в холодильник епрт иемператур е5°C н апротяжени и30–4 5ми .нПосл ефинальног оразбавлени я в 1м лра-з бавленнос йпермыд олжнс оодержатьс1 я0 0млс .нперматозоидо.в Посл е завершени я разбавлени я сперм у расфасовываю т в пайеты , которы еразмещаю в тпланшеты .В каждо йпайет едолжнс оодержатьс2 я 5млс .нперматозоидо.в Есл ирасфасовываюс тпермг в уранула( х 2,0млт ,)огд апосл ефинальног оразбавлени яфракцие йБ в 1мс лпермы должнс оодержатьс я 12 5млс .нперматозоидо.в Дл ядостижени я выравнивани яконцентрациг илицерин с анаружно й и внутренне й сторо н клеточно й мембраны достаточн о 4 ( чврем я эквилибрации .)Вт ечениэ етог овремен иокончательн оразбавленную спермв уыдерживаю тпрт иемператур е5°Cз а ,атемз амораживаю тп о стандартнот йехнологи .и Сперм убык аразбавляю с трасчетом получени я1 0– 1 5млс .нперматозоидо в с прямолинейно-поступательным движением пр и подвижност и н е мене е 4 балло .в Дл я расчет а степен и разбавлени я и-с пользую тформулу
С � А � V
Р = --------------- ,
0,01 0 � 1 0
