через катетер по системе трубок поступает в эмбриосборник или сосуд для его сбора. При использовании трехканального катетера необходимость прерывания циклов подачи и забора промывочного раствора отпадает, так как конструкция такого катетера позволяет проводить эти этапы синхронно. Для промывания одного рога матки используют 300-500 мл промывочного раствора.
Промывочные растворы, которые используются для вымывания эмбрионов, содержащие биологические продукты животного происхождения, не должны содержать патогенных микроорганизмов. Среды и растворы, используемые для вымывания эмбрионов, стерилизуют принятыми способами, описанными в Руководстве IETS (Международного общества пересадки эмбрионов), и подвергают манипуляциям в условиях, гарантирующих поддержание стерильности. Антибиотики должны добавляться в среды, используемые для отбора, манипуляции, промывки и хранения, согласно рекомендациям Руководства IETS.
Процедуру вымывания эмбрионов проводят, соблюдая все правила обращения с животными, техники безопасности и с соблюдением норм и правил ветеринарного контроля. После проведения процедуры вымывания эмбрионов составляют акт (см. приложения), где указывают все характеристики донора, применяемый метод, все характеристики используемого промывочного раствора.
3.6. Требования, предъявляемые к эмбрионам, полученным методом in vivo , и к условиям их обработки.
При получении эмбрионов методом in vivo проводят вымывание эмбрионов из матки донора на 7- 8 день после первого осеменения. Полученные таким способом эмбрионы коров подвергают микроскопическому исследованию при помощи стереомикроскопа или бинокулярной лупы при 150200-кратном увеличении. Характеризуют и классифицируют их согласно ГОСТ 28424-2014 «Средства воспроизводства. Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия» ( далее- ГОСТ 28424-2014) .
При работе с эмбрионами соблюдают все предписания и правила, отраженные в ГОСТ 28424-2014, в кодексе здоровья наземных животных МЭБ (глава 4.7 статья 4.7.5) и ветеринарном законодательстве РФ.
В плане распространения болезней пересадка эмбрионов, полученных in vivo , представляет собой метод передачи генетического материала, несущий низкий риск.
Вне зависимости от вида животных процесс получения и трансплантации
эмбрионов делится на три этапа, определяющие окончательный уровень риска:
1) Первый этап, относящийся к болезням, не входящим в категорию 1 по классификации IETS (Международного общества пересадки эмбрионов) (Статья 4.7.14. кодекса здоровья наземных животных), касается вероятности риска заражения эмбрионов, который зависит от:
а) эпизоотического положения региона;
б) ветеринарного состояния поголовья или стада и доноров, от которых получают эмбрионы;
в) патогенности возбудителей, от которых региональные органы ветеринарного контроля стремятся защитить свою территорию.
2) На втором этапе ведѐтся снижение риска с помощью международных принятых процедур обработки эмбрионов, которые определены в Руководстве IETS и ГОСТ 28424-2014.Такие процедуры включают следующие действия:
а) эмбрионы должны промываться минимум десятикратно при минимальном разведении 1/100 между каждой промывкой, а для переноса эмбрионов между промывками каждый раз должна обязательно использоваться новая пипетка;
б) допускается групповая промывка исключительно эмбрионов, взятых у одного животного, а их число не должно превышать десяти в каждой промывке;
в) после промывки исследуют блестящую оболочку каждого эмбриона по всей поверхности для исключения еѐ повреждении и отсутствия посторонних включений.
г) при транспортировке к эмбрионам должны прилагаться необходимые документы, подписанные ответственным ветеринарным врачом группы по получению эмбрионов, в котором подтверждается проведение указанной обработки эмбрионов.
Среды, используемые при обработке и промывки эмбрионов, в состав которых входят биологические продукты животного происхождения, не должны содержать патогенных микроорганизмов.
Среды и растворы, используемые для обработки и хранения эмбрионов, стерилизуют принятыми способами, описанными в Руководстве IETS, и подвергают манипуляциям в условиях, гарантирующих поддержание стерильности.
Антибиотики должны добавляться в среды, используемые для отбора, манипуляции, промывки и хранения, согласно рекомендациям Руководства IETS.
После проведенных лабораторных исследований составляют акт, где отражают все характеристики полученных эмбрионов (см. приложения).
3.7. Криоконсервация эмбрионов, полученных методом in vivo
Глубокое замораживание эмбрионов и хранение их в жидком азоте при температуре -196°С обеспечивает длительное сохранение их жизнеспособности и проведение трансплантации в любое удобное время.
Замораживание эмбрионов проводят с помощью автоматических программируемых аппаратов, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах.
Автоматические программные замораживатели являются сложными приборами, состоящими из 3-х основных частей: электронного блока, камеры для замораживания и емкости с жидким азотом. В качестве хладагента используют пары жидкого азота.
Для замораживания используют только свежеполученные эмбрионы отличного и хорошего качества согласно ГОСТ 28424-2014. Продолжительность времени подготовки эмбрионов к замораживанию должна быть минимальной. Работы по подготовке эмбрионов к замораживанию проводят в стерильном помещении с использованием стерильных инструментов.
Для защиты эмбрионов от негативного воздействия низких температур и повреждения при замораживании и оттаивании применяют криопротекторы (например, глицерин, этиленгликоль).
Перед замораживанием эмбрионы последовательно помещают в растворы криопротектора возрастающей концентрации, в каждом из них выдерживают для уравновешивания осмотического давления. Проводку эмбрионов через ряд последовательных концентраций производят под микроскопическим контролем. Используют четырехлуночные чашки Петри, которые накрывают сверху крышками и указывают на них номер донора.
Схема насыщения эмбрионов глицерином
| Порядковый | 1,0 М | раствора | 1,4 М | раствора |
|---|---|---|---|---|
| номер | концентрация | выдержка | концентрация | выдержка |
| раствора | глицерина | минут | глицерина | минут |
| 1 | 0,25 М | 5 | 0,46 М (3,3%) | 5 |
| 2 | 0,50 М | 5 | 0,92 М(6,6%) | 5 |
| 3 | 0,75 М | 5 | 1,4 М (10%) | 10 |
| 4 | 1,0 М | 10 | - |
После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы готовы к замораживанию.
Подготовленные к криоконсервированию эмбрионы переносят в пайеты
