3.7. Криоконсервация эмбрионов, полученных методом in vivo
Глубокое замораживание эмбрионов и хранение их в жидком азоте при температуре -196°С обеспечивает длительное сохранение их жизнеспособности и проведение трансплантации в любое удобное время.
Замораживание эмбрионов проводят с помощью автоматических программируемых аппаратов, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах.
Автоматические программные замораживатели являются сложными приборами, состоящими из 3-х основных частей: электронного блока, камеры для замораживания и емкости с жидким азотом. В качестве хладагента используют пары жидкого азота.
Для замораживания используют только свежеполученные эмбрионы отличного и хорошего качества согласно ГОСТ 28424-2014. Продолжительность времени подготовки эмбрионов к замораживанию должна быть минимальной. Работы по подготовке эмбрионов к замораживанию проводят в стерильном помещении с использованием стерильных инструментов.
Для защиты эмбрионов от негативного воздействия низких температур и повреждения при замораживании и оттаивании применяют криопротекторы (например, глицерин, этиленгликоль).
Перед замораживанием эмбрионы последовательно помещают в растворы криопротектора возрастающей концентрации, в каждом из них выдерживают для уравновешивания осмотического давления. Проводку эмбрионов через ряд последовательных концентраций производят под микроскопическим контролем. Используют четырехлуночные чашки Петри, которые накрывают сверху крышками и указывают на них номер донора.
Схема насыщения эмбрионов глицерином
| Порядковый | 1,0 М | раствора | 1,4 М | раствора |
|---|---|---|---|---|
| номер | концентрация | выдержка | концентрация | выдержка |
| раствора | глицерина | минут | глицерина | минут |
| 1 | 0,25 М | 5 | 0,46 М (3,3%) | 5 |
| 2 | 0,50 М | 5 | 0,92 М(6,6%) | 5 |
| 3 | 0,75 М | 5 | 1,4 М (10%) | 10 |
| 4 | 1,0 М | 10 | - |
После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы готовы к замораживанию.
Подготовленные к криоконсервированию эмбрионы переносят в пайеты
(соломинки) объемом 0,25 мл, в которых проводят замораживание эмбрионов. В соломинках замораживают по 1-2 эмбриона, заправку компонентов в соломинку проводят в такой последовательности: раствор культуральной среды (2/5 объема соломины), пузырек воздуха, 1,4 М глицерин, пузырек воздуха, эмбрион в 1,4 М глицерина (1/5 объема), воздух, 1,4 М раствор глицерина (2/5 объема соломы), пузырек воздуха, раствор культуральной среды. При этом обязательным условием является то, чтобы среда с эмбрионом не смешивалась и была разделена столбиком воздуха до оттаивания. В соломинку эмбрион переносят с помощью 1 мл шприца с резиновым переходником, либо микропипеткой. Среду подводят к пыжу, который размокая, фиксирует все столбики жидкостей, заправленные в пайету. Другой конец соломины закрывают пластмассовой пробкой подходящего диаметра.
Соломинки с эмбрионами маркируют и подвергают глубокому замораживанию. Данные маркировки заносят в соответствующий журнал. Процесс замораживания эмбрионов состоит из следующих этапов:
-
1) подготовленные для замораживания соломинки с эмбрионами, помещают в соответствующее гнездо замораживающей камеры и проводят охлаждение от 20 до -6°С/мин. со скоростью 1ºС/мин.;
-
2) затем проводят искусственную кристаллизацию ( Seeding). Для этого касаются стенки соломинки переохлажденным в жидком азоте пинцетом или каким-либо другим предметом;
-
3) охлаждение проводят со скоростью 0,3°С/мин. до -35°С;
4) осуществляют перенос эмбрионов в жидкий азот. Пайеты (соломинки) с эмбрионами помещают в охлажденный пластмассовый гоблет, на котором нестирающимся маркером указывается количество эмбрионов, номер донора и номер быка, порода, наименование хозяйства, дата замораживания. Гоблет помещают в сосуд Дьюара. Все манипуляции с пайетами с замороженными эмбрионами необходимо проводить в жидком азоте, избегая перепада температур, так как это отрицательно сказывается на качестве эмбрионов.
Замораживание эмбрионов проводят с соблюдением всех правил и требований, отраженных в кодексе здоровья наземных животных МЭБ (глава 4.7 статья 4.7.8).
Вся информация по криконсервации эмбрионов отражается в акте (см. приложения).
Методы получения и трансплантации эмбрионов коров in vitro
Многочисленными исследованиями показано, что ооциты из антральных фолликулов яичников коров и половозрелых телок могут дозревать in vitro. При этом непременным условием является сохранение связи ооцита с клетками кумулюса в процессе дозревания. Поэтому важно выделить из фолликулов ооциты в комплексе с окружающими клетками кумулюса, так называемые комплексы ооцит-кумулюс (КОК).
В технологии получения эмбрионов in vitro используются два способа получения женских гамет. Во-первых, ооциты могут быть аспирированы из поверхностных антральных фолликулов яичников животных прижизненно (метод ovum pick-up, OPU). Процедура выполняется с минимальным хирургическим вмешательством, при этом предварительная гормональная обработка животного не является обязательным условием, а выделенные ооциты дозревают in vitro . При этом выделение ооцитов у одного животного может проводиться с интервалом в 1–2 недели. Второй способ получения гамет представляет собой выделение ооцитов из антральных фолликулов постубойных животных.
При получении эмбрионов методом in vitro ооциты отбирают у доноров главным образом двумя методами: индивидуальный отбор и отбор партией. Рекомендуемые требования к каждому из них различны.
Индивидуальный отбор заключается обычно в том, что проводят интровагинальную пункцию яичников с целью аспирации фолликулярной жидкости с ооцитами у живых животных, осуществляется такая процедура на ферме, где содержатся животные или в лаборатории при помощи специального оборудования под визуальным контролем с применением узи-сканера. Иногда ооциты могут быть взяты из яичников живых доноров пункцией после ампутации этих органов. Когда ооциты извлекаются у живых животных, последующие процедуры, касающиеся доноров, должны находиться в соответствии с положениями и требованиями к донорам как при получении эмбрионов методом in vivo (глава 4.7 статья 4.7.4. кодекса здоровья наземных животных МЭБ). В этих случаях обязательны очистка и стерилизация инвентаря (например, зонда) после каждого использования у донора согласно рекомендациям, содержащимся в Руководстве Международного общества пересадки эмбрионов (IETS).
Если ведѐтся отбор партиями, яичники отбирают на бойне у убитых самок; затем изъятые яичники отправляют в лаборатории по обращению и
