криоконсервации или использовать криоконсервированные эмбрионы для трансплантации большому числу реципиентов.
Для управления половым циклом и синхронизации половой охоты у доноров и реципиентов применяют препараты, разрешѐнные к использованию на территории РФ и содержащие такие гормоны как - прогестерон, синтетические аналоги простагландина F2α, различные релизинг-факторы.
Для проведения мероприятий по управлению половыми циклами и синхронизации половой охоты у доноров и реципиентов применяют разработанные схемы и режимы введения гормональных препаратов.
Накопленные данные показывают, что асинхронность половых циклов у доноров и реципиентов снижает процент стельности, если реципиент приходит в охоту позднее донора более чем на 12 ч (-12ч) или раньше донора более чем на 24 ч (+24 ч). Поэтому при проведении мероприятий по синхронизации необходимо рассчитать длительность схем и режимов, чтобы день первого осеменения донора совпадал с днем охоты у реципиента. Следует иметь в виду, что синхронизация охоты донора и реципиента не должна проводиться отвлеченно, без учета стадии развития эмбрионов.
После проведения мероприятий по синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов составляют акт, где указывают применѐнные схемы и режимы введения гормонов, все характеристики применяемых препаратов и результаты гормональной обработки (см. приложение).
5.3. Трансплантация эмбрионов реципиентам
В практической работе по трансплантации эмбрионов применяют нехирургический метод пересадки. Трансплантация эмбрионов реципиентам нехирургическим методом представляет собой процедуру переноса эмбриона из пайеты (соломинки) в рог матки реципиента. Такая процедура проводится при помощи специальных катетеров под ректальным контролем половых органов. Этот метод требует хороших навыков, позволяющих избежать травмирования слизистой оболочки половых путей, и его проводят в строгом соответствии со всеми требованиями и правилами по контролю и профилактики инфекционных заболеваний.
Приживляемость эмбрионов в большой степени зависит от синхронности проявления эструса у доноров и реципиентов. Наилучшие результаты приживляемости эмбрионов достигаются при полной синхронности полового цикла у донора и реципиента. Допустимы отклонения синхронности не более чем на один день.
Успешность приживляемости пересаженных эмбрионов также зависит от места их локализации в роге матки при проведении процедуры трансплантации,
по накопленным данным у реципиентов чаще отмечалось наступление стельности, если трансплантируемый эмбрион был расположен оператором ближе к верхушке рога матки. В этой связи профессионализм оператора и технические возможностей используемого инструментария оказывают прямое влияние на успешность мероприятий по трансплантации эмбрионов.
Оборудование и инструменты.
Пересадка эмбрионов производится с помощью специальных катетеров со вспомогательными инструментами и различных расходных материалов. Мероприятие по пересадки эмбрионов состоит из следующих этапов: 1) Оттаивание эмбрионов
Оттаивание эмбрионов проводят в водяной бане при температуре воды 30°С . Требуемую соломинку быстро извлекают из канистры и помещают в водяную баню до момента почти полного исчезновения льда. Выдерживают в водяной бане 10-15 сек . Во время оттаивания соломинку плавно перемещают в воде маятникообразными движениями.
Оттаянные эмбрионы вместе со средой, в которой они находились в замороженном состоянии, переносят на стекло и проводят предварительную морфологическую оценку их качества. Эмбрионы последовательно помещают в заранее приготовленные растворы криопротектора в убывающей концентрации. Отмывку эмбрионов от криопротектора проводят по следующей схеме.
Схема отмывки эмбрионов от криопротектора - глицерина
| Порядковый номер раствора | 1 М раствора | 1,4 М раствора | ||
|---|---|---|---|---|
| концентрация глицерина | выдержка (мин) | концентрация глицерина | выдержка (мин) | |
| 1 | 1,0 М | 10 | 1,40 М | 10 |
| 2 | 0,75 М | 5 | 1,0 М | 5 |
| 3 | 0,50 М | 5 | 0,75 М | 5 |
| 4 | 0,25 М | 5 | 0,5 М | 5 |
| 5 | среда ФБС* | 10-20 | 0,25 М | 5 |
| 6 | среда ФБС* | 10-20 | ||
*ФБС - фосфатно-солевой буфер + 20% сыворотки крови
После трехкратной отмывки в ФБС + 20% сыворотки их помещают в эту же среду на 10-20 минут. Если были выявлены эмбрионы с морфологическими признаками, указывающими на их сомнительные качества, то такие эмбрионы выдерживают в термостате при 37°С до 2 часов с последующей их морфологической оценкой.
По окончании промывки оценивают жизнеспособность эмбрионов под микроскопом по морфологическим признакам. Эмбрионы, признанные
годными, используют для пересадки. Все операции по удалению криопротекторов проводят при комнатной температуре под микроскопическим контролем.
При использовании соломин, заправленных с сахарозой, проводят одноэтапное разбавление криопротектора раствором сахарозы в той же соломине. Для этого соломину после оттаивания встряхивают подобно клиническому термометру 3-4 раза для вытеснения пузырьков воздуха и смешивания, находящихся в ней растворов. Для уравновешения осмотического давления соломины размещают при температуре 25ºС или 37°С в вертикальном положении на 15 минут. Проводят смену положений «верх-низ» с таким расчетом, чтобы в конце выдержки пыж находился в верхнем положении. Под лупой контролируют наличие эмбриона в соломинке и, по возможности, определяют его качество. После проведения указанных манипуляций эмбрион готов к пересадке. Данные по подготовке и проведению замораживания и оттаивания эмбрионов заносят в журнал криоконсервирования и использования эмбрионов.
2) Заправка инструментов эмбрионами для пересадки.
Подготовка инструментов для пересадки эмбрионов проводится в боксе, в стерильных условиях. Для пересадки эмбрионов весь инструментарий перед работой стерилизуют кипячением в течение 30 мин, затем подсушивают и выдерживают до начала работы с эмбрионами в настольном боксе под бактерицидными лампами. Перед началом работы с эмбрионами включают бактерицидные лампы.
При использовании для пересадки классических инструментов типа Кассу эмбрион заправляют в длинную тонкую соломину (диаметром 1 мм). Заправленную соломину, вставляют в наконечник устройства и присоединяют его к основной трубке. Прибор готов к работе, он передается специалисту по пересадке или сохраняется непродолжительное время в термостате или специальном термоконтейнере при температуре 37°С . Такие инструменты, как правило, изготовлены из нержавеющих материалов, довольно жесткие и их технические возможности не позволяют осуществлять доставку трансплантируемого эмбриона в верхушку рога матки реципиента не нарушив целостности эндометрия.
При использовании для пересадки инструментов с эластичными капиллярами (патент РФ на полезную модель №154919 «Устройство для аппликации эмбрионов крупного рогатого скота» (авторы Косовский Г.Ю., Попов Д.В., Бригида А.В.)) эмбрион заправляют в эластичный капилляр и передают его оператору для пересадки. Такое устройство позволяет провести процедуру трансплантации эмбриона в верхушку рога матки реципиента, а
