отбору эмбрионов, где и производится отбор ооцитов аспирацией фолликулов. Отбор партиями имеет один недостаток, а именно – невозможность установления принадлежности поступивших в лабораторию яичников конкретным животным. Данный недостаток может быть устранен при дальнейшем развитии электронных методов идентификации отдельных животных. При этом следует строго следить за отбором исключительно здоровых тканей и добиваться, чтобы сам отбор у доноров и транспортировка материала в лаборатории проходили в надлежащих санитарных условиях.
Помимо этого:
1) Ветеринарным органам должно быть известно поголовье или стадо, из которого поступили доноры.
2) Доноры не должны поступать из поголовья или стада, на которое наложены ветеринарные ограничения по ящуру, чуме крупного рогатого скота, чумы мелких жвачных - ЧМЖ; отбор тканей или аспирация ооцитов не должны проводиться в заражѐнной зоне, а также в зоне, на которую наложены ветеринарные ограничения.
3) В случае отбора ооцитов у живых доноров следует проводить последующий надзор как их самих, так и поголовья или стада их происхождения.
4) Партии яичников и других тканей, отправляют в лабораторию, занимающуюся практическим получением эмбрионов методом in vitro , только после подтверждения, что результаты обследования доноров до и после убоя являются благоприятными.
7) Оборудование, используемое для взятия и транспортировки яичников и других тканей, предварительно подвергают стерилизации и применяют исключительно по назначению.
8) Регистрационные номера и данные о происхождении доноров вносятся в регистрационный журнал, который хранится в течение минимум 2-х лет, последовавших за получением эмбрионов.
В случае с отбором партиями могут возникнуть трудности со сбором таковых сведений. Однако регистрационные номера поголовий или стад, из которых поступили доноры, должны фиксироваться в отдельном деле.
После проведения отбора ооцитов составляется акт (см. приложения).
4.1. Технологические процедуры и требования к ним при получении эмбрионов методом in vitro
Использование метода ovum pick-up в технологии IVP может способствовать ускоренному получению потомства ценных в генетическом отношении животных, у которых имеются нарушения в воспроизводстве, не
связанные с функцией яичников, или не проявляется адекватная реакция суперовуляции в ответ на гормональную обработку. Более того, эта технология позволяет получать полноценные эмбрионы для трансплантации при выделении ооцитов из яичников здоровых животных, в том числе и находящихся на разных сроках стельности. Существенным достоинством этого источника является хорошее качество получаемых ооцитов.
Другим источником женских гамет являются яичники, получаемые при убое животных. В этом случае также могут быть разово получены эмбрионы от ценных особей, выбраковка которых по ряду причин необходима. В промышленном масштабе этот источник используется для увеличения поголовья и повышения генетического потенциала в мясном скотоводстве. Кроме того, именно на нем основываются области эмбриологии и биотехнологии, для которых требуется использование зрелых яйцеклеток или эмбрионов на самых ранних стадиях развития, например, получение клонированных и генетически-модифицированных животных. Это доступный и недорогой источник ооцитов крупного рогатого скота, хотя они по качеству могут уступать полученным методом ovum pick-up.
4.1.1Транспортировка яичников
После удаления из брюшной полости морфологически нормальные яичники освобождают от соединительной ткани и помещают в термос, содержащий стерильный раствор Дюльбекко или физиологический раствор с добавлением антибиотиков. Температура во время транспортировки зависит от времени, необходимого для доставки яичников в лабораторию.
4.1.2 Выделение ооцитов.
Выделяемые из яичников ооциты представляют собой предельно гетерогенную популяцию. На качество получаемых ооцитов может влиять ряд различных факторов, связанных с физиологическим статусом донора, в том числе уровень гормонов в крови и стадия эстрального цикла, а также морфология яичника, биохимические характеристики фолликулярной жидкости, диаметр и уровень атрезии фолликулов.
Яичники могут быть оценены по наличию и стадии желтого тела, а также по количеству и размеру поверхностных антральных фолликулов. Наибольшим потенциалом развития обладают ооциты, выделенные из яичников коров, находящихся на ранней лютеиновой стадии эстрального цикла, 0–7 дней, на поверхности которых имеется более 10 фолликулов с диаметром >10 мм или большое количество средних по размеру 2–5 мм в диаметре фолликулов.
Выделение ооцитов проводится в стерильных условиях при комнатной температуре около 25–27°C без применения нагревательных поверхностей.
Аспирация является наиболее распространенным и более быстрым методом выделения ооцитов, однако этот метод способствует нарушению целостности кумулюса в комплексе ооцит-кумулюс (КОК). Применение метода аспирации оправдано при стабильном поступлении достаточного количества яичников, что позволяет отбирать для дозревания наиболее подходящие по морфологическим показателям КОК.
При применении метода рассечения поверхности яичника получают большое количество ооцитов с неповрежденным кумулюсом, однако при этом общий пул получаемых ооцитов более гетерогенен.
При предварительном выделении цельных фолликулов определяют их уровень атрезии. Предварительное выделение фолликулов позволяет отобрать здоровые или находящиеся на ранних стадиях атрезии фолликулы для получения КОК. После разрывания стенки фолликула ооциты выделяются с сохранением целостности кумулюса, что существенно для качественного дозревания ооцитов in vitro .
4.1.3 Отбор ооцитов
В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуются ооциты, способные возобновлять мейоз, дозревать и оплодотворяться in vitro с получением жизнеспособных эмбрионов, пригодных для дальнейшей трансплантации.
4.1.4 Дозревание отобранных ооцитов
Дозревание отобранных ооцитов проводят в течение 22–23 часов после выделения в среде дозревания (например, TCM-199) с добавлением лабильных элементов (глутамина, пирувата, цистеина) и фетальной сыворотки коров.
Все технологические процедуры с ооцитами для получения эмбрионов методом in vitro должны проводиться согласно принятым протоколам с соблюдением всех правил и предписаний, направленных на исключение возможности распространения инфекционных заболеваний через трансплантацию эмбрионов, полученных таким способом и соблюдением техники безопасности.
4.1.5 Оплодотворение дозревших in vitro ооцитов
Для оплодотворения используют, как правило, криоконсервированное семя быков. Одним из методов выделяют фракцию подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред. Оплодотворяющая способность сперматозоидов может существенно варьировать у разных особей. Как правило, концентрация подвижных сперматозоидов при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота составляет 0,5-1,0 х 106 сперматозоидов/мл. Семя, используемое для оплодотворения ооцитов in vitro ,
