Методы получения и трансплантации эмбрионов коров in vitro
Многочисленными исследованиями показано, что ооциты из антральных фолликулов яичников коров и половозрелых телок могут дозревать in vitro. При этом непременным условием является сохранение связи ооцита с клетками кумулюса в процессе дозревания. Поэтому важно выделить из фолликулов ооциты в комплексе с окружающими клетками кумулюса, так называемые комплексы ооцит-кумулюс (КОК).
В технологии получения эмбрионов in vitro используются два способа получения женских гамет. Во-первых, ооциты могут быть аспирированы из поверхностных антральных фолликулов яичников животных прижизненно (метод ovum pick-up, OPU). Процедура выполняется с минимальным хирургическим вмешательством, при этом предварительная гормональная обработка животного не является обязательным условием, а выделенные ооциты дозревают in vitro . При этом выделение ооцитов у одного животного может проводиться с интервалом в 1–2 недели. Второй способ получения гамет представляет собой выделение ооцитов из антральных фолликулов постубойных животных.
При получении эмбрионов методом in vitro ооциты отбирают у доноров главным образом двумя методами: индивидуальный отбор и отбор партией. Рекомендуемые требования к каждому из них различны.
Индивидуальный отбор заключается обычно в том, что проводят интровагинальную пункцию яичников с целью аспирации фолликулярной жидкости с ооцитами у живых животных, осуществляется такая процедура на ферме, где содержатся животные или в лаборатории при помощи специального оборудования под визуальным контролем с применением узи-сканера. Иногда ооциты могут быть взяты из яичников живых доноров пункцией после ампутации этих органов. Когда ооциты извлекаются у живых животных, последующие процедуры, касающиеся доноров, должны находиться в соответствии с положениями и требованиями к донорам как при получении эмбрионов методом in vivo (глава 4.7 статья 4.7.4. кодекса здоровья наземных животных МЭБ). В этих случаях обязательны очистка и стерилизация инвентаря (например, зонда) после каждого использования у донора согласно рекомендациям, содержащимся в Руководстве Международного общества пересадки эмбрионов (IETS).
Если ведѐтся отбор партиями, яичники отбирают на бойне у убитых самок; затем изъятые яичники отправляют в лаборатории по обращению и
отбору эмбрионов, где и производится отбор ооцитов аспирацией фолликулов. Отбор партиями имеет один недостаток, а именно – невозможность установления принадлежности поступивших в лабораторию яичников конкретным животным. Данный недостаток может быть устранен при дальнейшем развитии электронных методов идентификации отдельных животных. При этом следует строго следить за отбором исключительно здоровых тканей и добиваться, чтобы сам отбор у доноров и транспортировка материала в лаборатории проходили в надлежащих санитарных условиях.
Помимо этого:
1) Ветеринарным органам должно быть известно поголовье или стадо, из которого поступили доноры.
2) Доноры не должны поступать из поголовья или стада, на которое наложены ветеринарные ограничения по ящуру, чуме крупного рогатого скота, чумы мелких жвачных - ЧМЖ; отбор тканей или аспирация ооцитов не должны проводиться в заражѐнной зоне, а также в зоне, на которую наложены ветеринарные ограничения.
3) В случае отбора ооцитов у живых доноров следует проводить последующий надзор как их самих, так и поголовья или стада их происхождения.
4) Партии яичников и других тканей, отправляют в лабораторию, занимающуюся практическим получением эмбрионов методом in vitro , только после подтверждения, что результаты обследования доноров до и после убоя являются благоприятными.
7) Оборудование, используемое для взятия и транспортировки яичников и других тканей, предварительно подвергают стерилизации и применяют исключительно по назначению.
8) Регистрационные номера и данные о происхождении доноров вносятся в регистрационный журнал, который хранится в течение минимум 2-х лет, последовавших за получением эмбрионов.
В случае с отбором партиями могут возникнуть трудности со сбором таковых сведений. Однако регистрационные номера поголовий или стад, из которых поступили доноры, должны фиксироваться в отдельном деле.
После проведения отбора ооцитов составляется акт (см. приложения).
4.1. Технологические процедуры и требования к ним при получении эмбрионов методом in vitro
Использование метода ovum pick-up в технологии IVP может способствовать ускоренному получению потомства ценных в генетическом отношении животных, у которых имеются нарушения в воспроизводстве, не
связанные с функцией яичников, или не проявляется адекватная реакция суперовуляции в ответ на гормональную обработку. Более того, эта технология позволяет получать полноценные эмбрионы для трансплантации при выделении ооцитов из яичников здоровых животных, в том числе и находящихся на разных сроках стельности. Существенным достоинством этого источника является хорошее качество получаемых ооцитов.
Другим источником женских гамет являются яичники, получаемые при убое животных. В этом случае также могут быть разово получены эмбрионы от ценных особей, выбраковка которых по ряду причин необходима. В промышленном масштабе этот источник используется для увеличения поголовья и повышения генетического потенциала в мясном скотоводстве. Кроме того, именно на нем основываются области эмбриологии и биотехнологии, для которых требуется использование зрелых яйцеклеток или эмбрионов на самых ранних стадиях развития, например, получение клонированных и генетически-модифицированных животных. Это доступный и недорогой источник ооцитов крупного рогатого скота, хотя они по качеству могут уступать полученным методом ovum pick-up.
4.1.1Транспортировка яичников
После удаления из брюшной полости морфологически нормальные яичники освобождают от соединительной ткани и помещают в термос, содержащий стерильный раствор Дюльбекко или физиологический раствор с добавлением антибиотиков. Температура во время транспортировки зависит от времени, необходимого для доставки яичников в лабораторию.
4.1.2 Выделение ооцитов.
Выделяемые из яичников ооциты представляют собой предельно гетерогенную популяцию. На качество получаемых ооцитов может влиять ряд различных факторов, связанных с физиологическим статусом донора, в том числе уровень гормонов в крови и стадия эстрального цикла, а также морфология яичника, биохимические характеристики фолликулярной жидкости, диаметр и уровень атрезии фолликулов.
Яичники могут быть оценены по наличию и стадии желтого тела, а также по количеству и размеру поверхностных антральных фолликулов. Наибольшим потенциалом развития обладают ооциты, выделенные из яичников коров, находящихся на ранней лютеиновой стадии эстрального цикла, 0–7 дней, на поверхности которых имеется более 10 фолликулов с диаметром >10 мм или большое количество средних по размеру 2–5 мм в диаметре фолликулов.
