Выделение ооцитов проводится в стерильных условиях при комнатной температуре около 25–27°C без применения нагревательных поверхностей.
Аспирация является наиболее распространенным и более быстрым методом выделения ооцитов, однако этот метод способствует нарушению целостности кумулюса в комплексе ооцит-кумулюс (КОК). Применение метода аспирации оправдано при стабильном поступлении достаточного количества яичников, что позволяет отбирать для дозревания наиболее подходящие по морфологическим показателям КОК.
При применении метода рассечения поверхности яичника получают большое количество ооцитов с неповрежденным кумулюсом, однако при этом общий пул получаемых ооцитов более гетерогенен.
При предварительном выделении цельных фолликулов определяют их уровень атрезии. Предварительное выделение фолликулов позволяет отобрать здоровые или находящиеся на ранних стадиях атрезии фолликулы для получения КОК. После разрывания стенки фолликула ооциты выделяются с сохранением целостности кумулюса, что существенно для качественного дозревания ооцитов in vitro .
4.1.3 Отбор ооцитов
В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуются ооциты, способные возобновлять мейоз, дозревать и оплодотворяться in vitro с получением жизнеспособных эмбрионов, пригодных для дальнейшей трансплантации.
4.1.4 Дозревание отобранных ооцитов
Дозревание отобранных ооцитов проводят в течение 22–23 часов после выделения в среде дозревания (например, TCM-199) с добавлением лабильных элементов (глутамина, пирувата, цистеина) и фетальной сыворотки коров.
Все технологические процедуры с ооцитами для получения эмбрионов методом in vitro должны проводиться согласно принятым протоколам с соблюдением всех правил и предписаний, направленных на исключение возможности распространения инфекционных заболеваний через трансплантацию эмбрионов, полученных таким способом и соблюдением техники безопасности.
4.1.5 Оплодотворение дозревших in vitro ооцитов
Для оплодотворения используют, как правило, криоконсервированное семя быков. Одним из методов выделяют фракцию подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред. Оплодотворяющая способность сперматозоидов может существенно варьировать у разных особей. Как правило, концентрация подвижных сперматозоидов при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота составляет 0,5-1,0 х 106 сперматозоидов/мл. Семя, используемое для оплодотворения ооцитов in vitro ,
должно соответствовать санитарным условиям и стандартам,
предусмотренным в Главе 4.6. кодекса здоровья наземных животных МЭБ в зависимости от вида животных. При использовании для оплодотворения ооцитов семени, происходящего от умерших производителей, или от таких, ветеринарный статус которых по одной или нескольким болезням, от которых требуется защититься, не был известен на момент отбора семени, могут потребоваться дополнительные исследования неиспользованных эмбрионов с целью удостоверения, что эти болезни не были им переданы. Другой метод предполагает исследование аликвотной части самого семени, отобранного в тот же день.
Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводят в среднем в течение 18–20 часов в средах, пригодных для оплодотворения (например, TALP-Fertility). День оплодотворения, обычно, считают нулевым. 4.1.6 Культивирование эмбрионов in vitro до ранних предимплантационных стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам
После завершения инкубирования ооцитов и сперматозоидов, предполагаемые зиготы освобождают от клеток кумулюса и помещают в среду культивирования (например, SOF, KSOM, и др.), содержащую соли неорганических кислот, включая бикарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия, глутамин, глюкозу, растворы заменимых и незаменимых аминокислот. В среду также добавляют фетальную сыворотку коров, бычий сывороточный альбумин или их макромолекулярные заменители (например, поливинилпирролидон) в сочетании с факторами роста и витаминами. Стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации (компактной морулы, бластоцисты, экспандированной бластоцисты), полученные in vitro эмбрионы достигают на 6-7 сутки культивирования.
4.1.7 Требования к работе с биологическим материалом и инструментами
Биологические продукты животного происхождения, в том числе культуральные клетки и составляющие жидкостей, использованных для отбора ооцитов, созревания, оплодотворения, культивирования, вымывания и хранения, не должны содержать живых патогенных возбудителей. Среды должны подвергаться предварительной стерилизации по утвержденным методикам, описанным в Руководстве IETS, а при манипуляциях оставаться стерильными. Антибиотики должны добавляться в жидкости и среды так, как рекомендовано в Руководстве IETS.
Инвентарь, используемый для отбора, манипуляций, культивирования, вымывания, замораживания и хранения ооцитов/эмбрионов, должен быть стерильным.
4.2. Требование к эмбрионам крупного рогатого скота, полученных методом in vitro
Оценку полученных in vitro эмбрионов коров проводят при помощи стереомикроскопа или бинокулярной лупы при 150-200-кратном увеличении. Характеризуют и классифицируют их согласно ГОСТ 28424-2014.
4.3. Криоконсервация эмбрионов полученных методом in vitro
Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные методом in vitro , по ряду морфофизиологических характеристик существенно отличаются от полученных in vivo эмбрионов и являются более чувствительными к воздействию факторов, связанных с криоконсервацией. В результате их криоконсервации с использованием технологии медленного замораживания жизнеспособность эмбрионов, полученных методом in vitro , существенно снижается.
В этой связи криоконсервацию эмбрионов, полученных методом in vitro , рекомендуется проводить методом витрификации. Витрификация представляет собой процесс перехода водных растворов при отрицательных температурах в стекловидное прозрачное твердое состояние без образования кристаллов льда. За счет своих технологических особенностей, в частности сверхвысокой скорости прохождения через критическую температурную зону в интервале от 15 до –5°С, в результате витрификация оказывается более эффективным методом криоконсервации, по сравнению с медленным замораживанием таких криочувствительных объектов, как полученные методом in vitro эмбрионы крупного рогатого скота. При проведении витрификации используется ряд проникающих (этиленгликоль, ДМСО, глицерин) и непроникающих (сахароза и т.д.) криопротекторов.
Основными этапами метода витрификации являются: инкубация эмбрионов в растворе эквилибрации, во время которой происходит вытеснение воды из цитоплазмы и насыщение эмбрионов проникающими криопротекторами; краткая инкубация в растворе витрификации, содержащего высокие концентрации проникающих и непроникающих криопротекторов, с целью обезвоживания эмбрионов, максимально быстрое погружение носителя с нанесенными на него эмбрионами в жидкий азот. При проведении отогревания витрифицированные эмбрионы максимально быстро переносят из жидкого азота в раствор отогревания, содержащий непроникающие криопротекторы в высокой концентрации, а затем проводят через ряд растворов с постепенно понижающейся осмолярностью. Большинство современных методик витрификации с высокой результативностью основываются на принципе охлаждения минимального объема. Для достижения максимальных скоростей
