4.2. Требование к эмбрионам крупного рогатого скота, полученных методом in vitro
Оценку полученных in vitro эмбрионов коров проводят при помощи стереомикроскопа или бинокулярной лупы при 150-200-кратном увеличении. Характеризуют и классифицируют их согласно ГОСТ 28424-2014.
4.3. Криоконсервация эмбрионов полученных методом in vitro
Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные методом in vitro , по ряду морфофизиологических характеристик существенно отличаются от полученных in vivo эмбрионов и являются более чувствительными к воздействию факторов, связанных с криоконсервацией. В результате их криоконсервации с использованием технологии медленного замораживания жизнеспособность эмбрионов, полученных методом in vitro , существенно снижается.
В этой связи криоконсервацию эмбрионов, полученных методом in vitro , рекомендуется проводить методом витрификации. Витрификация представляет собой процесс перехода водных растворов при отрицательных температурах в стекловидное прозрачное твердое состояние без образования кристаллов льда. За счет своих технологических особенностей, в частности сверхвысокой скорости прохождения через критическую температурную зону в интервале от 15 до –5°С, в результате витрификация оказывается более эффективным методом криоконсервации, по сравнению с медленным замораживанием таких криочувствительных объектов, как полученные методом in vitro эмбрионы крупного рогатого скота. При проведении витрификации используется ряд проникающих (этиленгликоль, ДМСО, глицерин) и непроникающих (сахароза и т.д.) криопротекторов.
Основными этапами метода витрификации являются: инкубация эмбрионов в растворе эквилибрации, во время которой происходит вытеснение воды из цитоплазмы и насыщение эмбрионов проникающими криопротекторами; краткая инкубация в растворе витрификации, содержащего высокие концентрации проникающих и непроникающих криопротекторов, с целью обезвоживания эмбрионов, максимально быстрое погружение носителя с нанесенными на него эмбрионами в жидкий азот. При проведении отогревания витрифицированные эмбрионы максимально быстро переносят из жидкого азота в раствор отогревания, содержащий непроникающие криопротекторы в высокой концентрации, а затем проводят через ряд растворов с постепенно понижающейся осмолярностью. Большинство современных методик витрификации с высокой результативностью основываются на принципе охлаждения минимального объема. Для достижения максимальных скоростей
охлаждения и нагревания объем образца, содержащего эмбрионы, не должен превышать 0,1 мкл. При криоконсервации по методу витрификации полученных in vitro эмбрионов млекопитающих используется широкий ряд носителей открытого и закрытого типов (Патент РФ на изобретение №2584584 от 20.05.16г. «Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна» (авторы Маленко Г. П., Корниенко Е. В., Косовский Г. Ю. )).
Требования к консервации и транспортировке эмбрионов согласно кодексу здоровья наземных животных МЭБ:
1) В одну группу криоконсервации должны входить эмбрионы, полученные от одной самки-донора или происходящие из одной партии.
2) Эмбрионы должны криоконсервироваться в очищенных и стерильных контейнерах с жидким азотом, а затем храниться с соблюдением строгих условий гигиены в специально предназначенном для этой цели месте.
3) Носители с криоконсервированными эмбрионами маркируются, как указано в Руководстве IETS.
4) После проведения процедуры по криоконсервации эмбрионов заполняют соответствующую документацию, в которой отражены характеристики доноров, эмбрионов и проведенных процедур.
ГЛАВА 5
Этапы и техника трансплантации эмбрионов
5.1. Требование к реципиентам
В качестве реципиентов отбираются взрослые коровы и телки:
-
тѐлок для использования в качестве реципиентов отбирают в возрасте 16-20 мес., с живой массой 340-400 кг;
-
реципиенты должны иметь крепкую конституцию и заводскую
-
упитанность;
-
отобранные реципиенты должны быть сосредоточены в стационарном месте со стабильным полноценным рационом кормления в течение 3-х мес. после трансплантации эмбрионов;
-
реципиенты должны быть клинически здоровыми;
-
проходить обязательное обследование на инфекционные заболевания
-
(бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.)
-
обязательная дегельминтизация предоставляемого поголовья для отбора в качестве реципиентов за 1,5 месяца до пересадки эмбрионов;
-
обязательное проведение биохимического анализа крови предоставляемого поголовья для отбора в качестве реципиентов на содержание макро- и микроэлементов и представлением результатов анализа;
-
реципиенты должны быть с нормальной физиологией половой системы без патологии родовых путей;
-
в качестве реципиентов используют наименее ценных в племенном отношении животных;
-
нельзя использовать в качестве реципиентов животных мелких пород для трансплантации эмбрионов от пород более крупных по массе.
После проведения мероприятий по отбору и комплектования группы реципиентов составляется акт (см. приложения).
5.2. Требование к методам управления и синхронизации половых циклов у доноров и реципиентов.
Управление половым циклом и синхронизация половой охоты (в пределах ± 12 ч) у доноров и реципиентов - важный элемент подготовки животных к получению и пересадке эмбрионов в запланированные сроки.
При подготовке реципиентов к трансплантации свежеполученных эмбрионов необходимо учитывать, что ко времени процедуры не все отобранные и прошедшие гормональную обработку реципиенты будут подходить по необходимым показателям к тому, чтобы им провели трансплантацию эмбриона. В этой связи надо исходить из расчета потребности на 1 донора должно быть подготовлено 3-5 реципиентов, при этом половая охота у подготавливаемых реципиентов должна совпадать с днем первого осеменения донора. Число реципиентов на одного донора может быть увеличено до 10 и более при суперовуляции донора, имеющего стабильный и высокий выход пригодных эмбрионов, а также при наличии криоконсервированных эмбрионов.
В практической работе по трансплантации эмбрионов коров выявить необходимое число реципиентов в спонтанной половой охоте в течение одного дня практически невозможно. Поэтому чтобы ко времени пересадки эмбрионов было необходимое поголовье реципиентов, проводят гормональную обработку отобранным для трансплантации коровам и телкам с целью управления их половым циклом и индуцирования у них половой охоты.
Гормональная обработка доноров и реципиентов позволяет управлять интроовариальными процессами, выравнивая стадии полового цикла, что позволяет планировать работы при пересадке эмбрионов без их
