связанные с функцией яичников, или не проявляется адекватная реакция суперовуляции в ответ на гормональную обработку. Более того, эта технология позволяет получать полноценные эмбрионы для трансплантации при выделении ооцитов из яичников здоровых животных, в том числе и находящихся на разных сроках стельности. Существенным достоинством этого источника является хорошее качество получаемых ооцитов.
Другим источником женских гамет являются яичники, получаемые при убое животных. В этом случае также могут быть разово получены эмбрионы от ценных особей, выбраковка которых по ряду причин необходима. В промышленном масштабе этот источник используется для увеличения поголовья и повышения генетического потенциала в мясном скотоводстве. Кроме того, именно на нем основываются области эмбриологии и биотехнологии, для которых требуется использование зрелых яйцеклеток или эмбрионов на самых ранних стадиях развития, например, получение клонированных и генетически-модифицированных животных. Это доступный и недорогой источник ооцитов крупного рогатого скота, хотя они по качеству могут уступать полученным методом ovum pick-up.
4.1.1Транспортировка яичников
После удаления из брюшной полости морфологически нормальные яичники освобождают от соединительной ткани и помещают в термос, содержащий стерильный раствор Дюльбекко или физиологический раствор с добавлением антибиотиков. Температура во время транспортировки зависит от времени, необходимого для доставки яичников в лабораторию.
4.1.2 Выделение ооцитов.
Выделяемые из яичников ооциты представляют собой предельно гетерогенную популяцию. На качество получаемых ооцитов может влиять ряд различных факторов, связанных с физиологическим статусом донора, в том числе уровень гормонов в крови и стадия эстрального цикла, а также морфология яичника, биохимические характеристики фолликулярной жидкости, диаметр и уровень атрезии фолликулов.
Яичники могут быть оценены по наличию и стадии желтого тела, а также по количеству и размеру поверхностных антральных фолликулов. Наибольшим потенциалом развития обладают ооциты, выделенные из яичников коров, находящихся на ранней лютеиновой стадии эстрального цикла, 0–7 дней, на поверхности которых имеется более 10 фолликулов с диаметром >10 мм или большое количество средних по размеру 2–5 мм в диаметре фолликулов.
Выделение ооцитов проводится в стерильных условиях при комнатной температуре около 25–27°C без применения нагревательных поверхностей.
Аспирация является наиболее распространенным и более быстрым методом выделения ооцитов, однако этот метод способствует нарушению целостности кумулюса в комплексе ооцит-кумулюс (КОК). Применение метода аспирации оправдано при стабильном поступлении достаточного количества яичников, что позволяет отбирать для дозревания наиболее подходящие по морфологическим показателям КОК.
При применении метода рассечения поверхности яичника получают большое количество ооцитов с неповрежденным кумулюсом, однако при этом общий пул получаемых ооцитов более гетерогенен.
При предварительном выделении цельных фолликулов определяют их уровень атрезии. Предварительное выделение фолликулов позволяет отобрать здоровые или находящиеся на ранних стадиях атрезии фолликулы для получения КОК. После разрывания стенки фолликула ооциты выделяются с сохранением целостности кумулюса, что существенно для качественного дозревания ооцитов in vitro .
4.1.3 Отбор ооцитов
В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro требуются ооциты, способные возобновлять мейоз, дозревать и оплодотворяться in vitro с получением жизнеспособных эмбрионов, пригодных для дальнейшей трансплантации.
4.1.4 Дозревание отобранных ооцитов
Дозревание отобранных ооцитов проводят в течение 22–23 часов после выделения в среде дозревания (например, TCM-199) с добавлением лабильных элементов (глутамина, пирувата, цистеина) и фетальной сыворотки коров.
Все технологические процедуры с ооцитами для получения эмбрионов методом in vitro должны проводиться согласно принятым протоколам с соблюдением всех правил и предписаний, направленных на исключение возможности распространения инфекционных заболеваний через трансплантацию эмбрионов, полученных таким способом и соблюдением техники безопасности.
4.1.5 Оплодотворение дозревших in vitro ооцитов
Для оплодотворения используют, как правило, криоконсервированное семя быков. Одним из методов выделяют фракцию подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред. Оплодотворяющая способность сперматозоидов может существенно варьировать у разных особей. Как правило, концентрация подвижных сперматозоидов при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота составляет 0,5-1,0 х 106 сперматозоидов/мл. Семя, используемое для оплодотворения ооцитов in vitro ,
должно соответствовать санитарным условиям и стандартам,
предусмотренным в Главе 4.6. кодекса здоровья наземных животных МЭБ в зависимости от вида животных. При использовании для оплодотворения ооцитов семени, происходящего от умерших производителей, или от таких, ветеринарный статус которых по одной или нескольким болезням, от которых требуется защититься, не был известен на момент отбора семени, могут потребоваться дополнительные исследования неиспользованных эмбрионов с целью удостоверения, что эти болезни не были им переданы. Другой метод предполагает исследование аликвотной части самого семени, отобранного в тот же день.
Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводят в среднем в течение 18–20 часов в средах, пригодных для оплодотворения (например, TALP-Fertility). День оплодотворения, обычно, считают нулевым. 4.1.6 Культивирование эмбрионов in vitro до ранних предимплантационных стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам
После завершения инкубирования ооцитов и сперматозоидов, предполагаемые зиготы освобождают от клеток кумулюса и помещают в среду культивирования (например, SOF, KSOM, и др.), содержащую соли неорганических кислот, включая бикарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия, глутамин, глюкозу, растворы заменимых и незаменимых аминокислот. В среду также добавляют фетальную сыворотку коров, бычий сывороточный альбумин или их макромолекулярные заменители (например, поливинилпирролидон) в сочетании с факторами роста и витаминами. Стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации (компактной морулы, бластоцисты, экспандированной бластоцисты), полученные in vitro эмбрионы достигают на 6-7 сутки культивирования.
4.1.7 Требования к работе с биологическим материалом и инструментами
Биологические продукты животного происхождения, в том числе культуральные клетки и составляющие жидкостей, использованных для отбора ооцитов, созревания, оплодотворения, культивирования, вымывания и хранения, не должны содержать живых патогенных возбудителей. Среды должны подвергаться предварительной стерилизации по утвержденным методикам, описанным в Руководстве IETS, а при манипуляциях оставаться стерильными. Антибиотики должны добавляться в жидкости и среды так, как рекомендовано в Руководстве IETS.
Инвентарь, используемый для отбора, манипуляций, культивирования, вымывания, замораживания и хранения ооцитов/эмбрионов, должен быть стерильным.
