Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота

эмбрионов делится на три этапа, определяющие окончательный уровень риска:

1) Первый этап, относящийся к болезням, не входящим в категорию 1 по классификации IETS (Международного общества пересадки эмбрионов) (Статья 4.7.14. кодекса здоровья наземных животных), касается вероятности риска заражения эмбрионов, который зависит от:

а) эпизоотического положения региона;

б) ветеринарного состояния поголовья или стада и доноров, от которых получают эмбрионы;

в) патогенности возбудителей, от которых региональные органы ветеринарного контроля стремятся защитить свою территорию.

2) На втором этапе ведѐтся снижение риска с помощью международных принятых процедур обработки эмбрионов, которые определены в Руководстве IETS и ГОСТ 28424-2014.Такие процедуры включают следующие действия:

а) эмбрионы должны промываться минимум десятикратно при минимальном разведении 1/100 между каждой промывкой, а для переноса эмбрионов между промывками каждый раз должна обязательно использоваться новая пипетка;

б) допускается групповая промывка исключительно эмбрионов, взятых у одного животного, а их число не должно превышать десяти в каждой промывке;

в) после промывки исследуют блестящую оболочку каждого эмбриона по всей поверхности для исключения еѐ повреждении и отсутствия посторонних включений.

г) при транспортировке к эмбрионам должны прилагаться необходимые документы, подписанные ответственным ветеринарным врачом группы по получению эмбрионов, в котором подтверждается проведение указанной обработки эмбрионов.

Среды, используемые при обработке и промывки эмбрионов, в состав которых входят биологические продукты животного происхождения, не должны содержать патогенных микроорганизмов.

Среды и растворы, используемые для обработки и хранения эмбрионов, стерилизуют принятыми способами, описанными в Руководстве IETS, и подвергают манипуляциям в условиях, гарантирующих поддержание стерильности.

Антибиотики должны добавляться в среды, используемые для отбора, манипуляции, промывки и хранения, согласно рекомендациям Руководства IETS.

После проведенных лабораторных исследований составляют акт, где отражают все характеристики полученных эмбрионов (см. приложения).

3.7. Криоконсервация эмбрионов, полученных методом in vivo

Глубокое замораживание эмбрионов и хранение их в жидком азоте при температуре -196°С обеспечивает длительное сохранение их жизнеспособности и проведение трансплантации в любое удобное время.

Замораживание эмбрионов проводят с помощью автоматических программируемых аппаратов, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах.

Автоматические программные замораживатели являются сложными приборами, состоящими из 3-х основных частей: электронного блока, камеры для замораживания и емкости с жидким азотом. В качестве хладагента используют пары жидкого азота.

Для замораживания используют только свежеполученные эмбрионы отличного и хорошего качества согласно ГОСТ 28424-2014. Продолжительность времени подготовки эмбрионов к замораживанию должна быть минимальной. Работы по подготовке эмбрионов к замораживанию проводят в стерильном помещении с использованием стерильных инструментов.

Для защиты эмбрионов от негативного воздействия низких температур и повреждения при замораживании и оттаивании применяют криопротекторы (например, глицерин, этиленгликоль).

Перед замораживанием эмбрионы последовательно помещают в растворы криопротектора возрастающей концентрации, в каждом из них выдерживают для уравновешивания осмотического давления. Проводку эмбрионов через ряд последовательных концентраций производят под микроскопическим контролем. Используют четырехлуночные чашки Петри, которые накрывают сверху крышками и указывают на них номер донора.

Схема насыщения эмбрионов глицерином

После выдержки в последнем растворе криопротектора эмбрионы готовы к замораживанию.

Подготовленные к криоконсервированию эмбрионы переносят в пайеты

(соломинки) объемом 0,25 мл, в которых проводят замораживание эмбрионов. В соломинках замораживают по 1-2 эмбриона, заправку компонентов в соломинку проводят в такой последовательности: раствор культуральной среды (2/5 объема соломины), пузырек воздуха, 1,4 М глицерин, пузырек воздуха, эмбрион в 1,4 М глицерина (1/5 объема), воздух, 1,4 М раствор глицерина (2/5 объема соломы), пузырек воздуха, раствор культуральной среды. При этом обязательным условием является то, чтобы среда с эмбрионом не смешивалась и была разделена столбиком воздуха до оттаивания. В соломинку эмбрион переносят с помощью 1 мл шприца с резиновым переходником, либо микропипеткой. Среду подводят к пыжу, который размокая, фиксирует все столбики жидкостей, заправленные в пайету. Другой конец соломины закрывают пластмассовой пробкой подходящего диаметра.

Соломинки с эмбрионами маркируют и подвергают глубокому замораживанию. Данные маркировки заносят в соответствующий журнал. Процесс замораживания эмбрионов состоит из следующих этапов:

• 1) подготовленные для замораживания соломинки с эмбрионами, помещают в соответствующее гнездо замораживающей камеры и проводят охлаждение от 20 до -6°С/мин. со скоростью 1ºС/мин.;

• 2) затем проводят искусственную кристаллизацию ( Seeding). Для этого касаются стенки соломинки переохлажденным в жидком азоте пинцетом или каким-либо другим предметом;

• 3) охлаждение проводят со скоростью 0,3°С/мин. до -35°С;

4) осуществляют перенос эмбрионов в жидкий азот. Пайеты (соломинки) с эмбрионами помещают в охлажденный пластмассовый гоблет, на котором нестирающимся маркером указывается количество эмбрионов, номер донора и номер быка, порода, наименование хозяйства, дата замораживания. Гоблет помещают в сосуд Дьюара. Все манипуляции с пайетами с замороженными эмбрионами необходимо проводить в жидком азоте, избегая перепада температур, так как это отрицательно сказывается на качестве эмбрионов.

Замораживание эмбрионов проводят с соблюдением всех правил и требований, отраженных в кодексе здоровья наземных животных МЭБ (глава 4.7 статья 4.7.8).

Вся информация по криконсервации эмбрионов отражается в акте (см. приложения).