должно соответствовать санитарным условиям и стандартам,
предусмотренным в Главе 4.6. кодекса здоровья наземных животных МЭБ в зависимости от вида животных. При использовании для оплодотворения ооцитов семени, происходящего от умерших производителей, или от таких, ветеринарный статус которых по одной или нескольким болезням, от которых требуется защититься, не был известен на момент отбора семени, могут потребоваться дополнительные исследования неиспользованных эмбрионов с целью удостоверения, что эти болезни не были им переданы. Другой метод предполагает исследование аликвотной части самого семени, отобранного в тот же день.
Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводят в среднем в течение 18–20 часов в средах, пригодных для оплодотворения (например, TALP-Fertility). День оплодотворения, обычно, считают нулевым. 4.1.6 Культивирование эмбрионов in vitro до ранних предимплантационных стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации реципиентам
После завершения инкубирования ооцитов и сперматозоидов, предполагаемые зиготы освобождают от клеток кумулюса и помещают в среду культивирования (например, SOF, KSOM, и др.), содержащую соли неорганических кислот, включая бикарбонат натрия, пируват натрия, лактат натрия, глутамин, глюкозу, растворы заменимых и незаменимых аминокислот. В среду также добавляют фетальную сыворотку коров, бычий сывороточный альбумин или их макромолекулярные заменители (например, поливинилпирролидон) в сочетании с факторами роста и витаминами. Стадий развития, пригодных для нехирургической трансплантации (компактной морулы, бластоцисты, экспандированной бластоцисты), полученные in vitro эмбрионы достигают на 6-7 сутки культивирования.
4.1.7 Требования к работе с биологическим материалом и инструментами
Биологические продукты животного происхождения, в том числе культуральные клетки и составляющие жидкостей, использованных для отбора ооцитов, созревания, оплодотворения, культивирования, вымывания и хранения, не должны содержать живых патогенных возбудителей. Среды должны подвергаться предварительной стерилизации по утвержденным методикам, описанным в Руководстве IETS, а при манипуляциях оставаться стерильными. Антибиотики должны добавляться в жидкости и среды так, как рекомендовано в Руководстве IETS.
Инвентарь, используемый для отбора, манипуляций, культивирования, вымывания, замораживания и хранения ооцитов/эмбрионов, должен быть стерильным.
4.2. Требование к эмбрионам крупного рогатого скота, полученных методом in vitro
Оценку полученных in vitro эмбрионов коров проводят при помощи стереомикроскопа или бинокулярной лупы при 150-200-кратном увеличении. Характеризуют и классифицируют их согласно ГОСТ 28424-2014.
4.3. Криоконсервация эмбрионов полученных методом in vitro
Эмбрионы крупного рогатого скота, полученные методом in vitro , по ряду морфофизиологических характеристик существенно отличаются от полученных in vivo эмбрионов и являются более чувствительными к воздействию факторов, связанных с криоконсервацией. В результате их криоконсервации с использованием технологии медленного замораживания жизнеспособность эмбрионов, полученных методом in vitro , существенно снижается.
В этой связи криоконсервацию эмбрионов, полученных методом in vitro , рекомендуется проводить методом витрификации. Витрификация представляет собой процесс перехода водных растворов при отрицательных температурах в стекловидное прозрачное твердое состояние без образования кристаллов льда. За счет своих технологических особенностей, в частности сверхвысокой скорости прохождения через критическую температурную зону в интервале от 15 до –5°С, в результате витрификация оказывается более эффективным методом криоконсервации, по сравнению с медленным замораживанием таких криочувствительных объектов, как полученные методом in vitro эмбрионы крупного рогатого скота. При проведении витрификации используется ряд проникающих (этиленгликоль, ДМСО, глицерин) и непроникающих (сахароза и т.д.) криопротекторов.
Основными этапами метода витрификации являются: инкубация эмбрионов в растворе эквилибрации, во время которой происходит вытеснение воды из цитоплазмы и насыщение эмбрионов проникающими криопротекторами; краткая инкубация в растворе витрификации, содержащего высокие концентрации проникающих и непроникающих криопротекторов, с целью обезвоживания эмбрионов, максимально быстрое погружение носителя с нанесенными на него эмбрионами в жидкий азот. При проведении отогревания витрифицированные эмбрионы максимально быстро переносят из жидкого азота в раствор отогревания, содержащий непроникающие криопротекторы в высокой концентрации, а затем проводят через ряд растворов с постепенно понижающейся осмолярностью. Большинство современных методик витрификации с высокой результативностью основываются на принципе охлаждения минимального объема. Для достижения максимальных скоростей
охлаждения и нагревания объем образца, содержащего эмбрионы, не должен превышать 0,1 мкл. При криоконсервации по методу витрификации полученных in vitro эмбрионов млекопитающих используется широкий ряд носителей открытого и закрытого типов (Патент РФ на изобретение №2584584 от 20.05.16г. «Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна» (авторы Маленко Г. П., Корниенко Е. В., Косовский Г. Ю. )).
Требования к консервации и транспортировке эмбрионов согласно кодексу здоровья наземных животных МЭБ:
1) В одну группу криоконсервации должны входить эмбрионы, полученные от одной самки-донора или происходящие из одной партии.
2) Эмбрионы должны криоконсервироваться в очищенных и стерильных контейнерах с жидким азотом, а затем храниться с соблюдением строгих условий гигиены в специально предназначенном для этой цели месте.
3) Носители с криоконсервированными эмбрионами маркируются, как указано в Руководстве IETS.
4) После проведения процедуры по криоконсервации эмбрионов заполняют соответствующую документацию, в которой отражены характеристики доноров, эмбрионов и проведенных процедур.
ГЛАВА 5
Этапы и техника трансплантации эмбрионов
5.1. Требование к реципиентам
В качестве реципиентов отбираются взрослые коровы и телки:
-
тѐлок для использования в качестве реципиентов отбирают в возрасте 16-20 мес., с живой массой 340-400 кг;
-
реципиенты должны иметь крепкую конституцию и заводскую
-
упитанность;
-
отобранные реципиенты должны быть сосредоточены в стационарном месте со стабильным полноценным рационом кормления в течение 3-х мес. после трансплантации эмбрионов;
-
реципиенты должны быть клинически здоровыми;
-
проходить обязательное обследование на инфекционные заболевания
-
(бруцеллез, туберкулез, вирусные респираторные заболевания, лейкоз, трихомоноз, вибриоз, ящур и др.)
