по накопленным данным у реципиентов чаще отмечалось наступление стельности, если трансплантируемый эмбрион был расположен оператором ближе к верхушке рога матки. В этой связи профессионализм оператора и технические возможностей используемого инструментария оказывают прямое влияние на успешность мероприятий по трансплантации эмбрионов.
Оборудование и инструменты.
Пересадка эмбрионов производится с помощью специальных катетеров со вспомогательными инструментами и различных расходных материалов. Мероприятие по пересадки эмбрионов состоит из следующих этапов: 1) Оттаивание эмбрионов
Оттаивание эмбрионов проводят в водяной бане при температуре воды 30°С . Требуемую соломинку быстро извлекают из канистры и помещают в водяную баню до момента почти полного исчезновения льда. Выдерживают в водяной бане 10-15 сек . Во время оттаивания соломинку плавно перемещают в воде маятникообразными движениями.
Оттаянные эмбрионы вместе со средой, в которой они находились в замороженном состоянии, переносят на стекло и проводят предварительную морфологическую оценку их качества. Эмбрионы последовательно помещают в заранее приготовленные растворы криопротектора в убывающей концентрации. Отмывку эмбрионов от криопротектора проводят по следующей схеме.
Схема отмывки эмбрионов от криопротектора - глицерина
| Порядковый номер раствора | 1 М раствора | 1,4 М раствора | ||
|---|---|---|---|---|
| концентрация глицерина | выдержка (мин) | концентрация глицерина | выдержка (мин) | |
| 1 | 1,0 М | 10 | 1,40 М | 10 |
| 2 | 0,75 М | 5 | 1,0 М | 5 |
| 3 | 0,50 М | 5 | 0,75 М | 5 |
| 4 | 0,25 М | 5 | 0,5 М | 5 |
| 5 | среда ФБС* | 10-20 | 0,25 М | 5 |
| 6 | среда ФБС* | 10-20 | ||
*ФБС - фосфатно-солевой буфер + 20% сыворотки крови
После трехкратной отмывки в ФБС + 20% сыворотки их помещают в эту же среду на 10-20 минут. Если были выявлены эмбрионы с морфологическими признаками, указывающими на их сомнительные качества, то такие эмбрионы выдерживают в термостате при 37°С до 2 часов с последующей их морфологической оценкой.
По окончании промывки оценивают жизнеспособность эмбрионов под микроскопом по морфологическим признакам. Эмбрионы, признанные
годными, используют для пересадки. Все операции по удалению криопротекторов проводят при комнатной температуре под микроскопическим контролем.
При использовании соломин, заправленных с сахарозой, проводят одноэтапное разбавление криопротектора раствором сахарозы в той же соломине. Для этого соломину после оттаивания встряхивают подобно клиническому термометру 3-4 раза для вытеснения пузырьков воздуха и смешивания, находящихся в ней растворов. Для уравновешения осмотического давления соломины размещают при температуре 25ºС или 37°С в вертикальном положении на 15 минут. Проводят смену положений «верх-низ» с таким расчетом, чтобы в конце выдержки пыж находился в верхнем положении. Под лупой контролируют наличие эмбриона в соломинке и, по возможности, определяют его качество. После проведения указанных манипуляций эмбрион готов к пересадке. Данные по подготовке и проведению замораживания и оттаивания эмбрионов заносят в журнал криоконсервирования и использования эмбрионов.
2) Заправка инструментов эмбрионами для пересадки.
Подготовка инструментов для пересадки эмбрионов проводится в боксе, в стерильных условиях. Для пересадки эмбрионов весь инструментарий перед работой стерилизуют кипячением в течение 30 мин, затем подсушивают и выдерживают до начала работы с эмбрионами в настольном боксе под бактерицидными лампами. Перед началом работы с эмбрионами включают бактерицидные лампы.
При использовании для пересадки классических инструментов типа Кассу эмбрион заправляют в длинную тонкую соломину (диаметром 1 мм). Заправленную соломину, вставляют в наконечник устройства и присоединяют его к основной трубке. Прибор готов к работе, он передается специалисту по пересадке или сохраняется непродолжительное время в термостате или специальном термоконтейнере при температуре 37°С . Такие инструменты, как правило, изготовлены из нержавеющих материалов, довольно жесткие и их технические возможности не позволяют осуществлять доставку трансплантируемого эмбриона в верхушку рога матки реципиента не нарушив целостности эндометрия.
При использовании для пересадки инструментов с эластичными капиллярами (патент РФ на полезную модель №154919 «Устройство для аппликации эмбрионов крупного рогатого скота» (авторы Косовский Г.Ю., Попов Д.В., Бригида А.В.)) эмбрион заправляют в эластичный капилляр и передают его оператору для пересадки. Такое устройство позволяет провести процедуру трансплантации эмбриона в верхушку рога матки реципиента, а
также осуществлять транспортировку и трансплантацию эмбрионов на фермах за несколько километров от пункта трансплантации. При этом теплый (37°С) заряженный капилляр помещают в утепленный контейнер, имеющий внутри такую же температуру. Контейнер транспортируют в горизонтальном положении, избегая резких толчков и наклонов. Запасные соломины с эмбрионами для пересадки перевозят в тщательно упакованном виде в этом же контейнере при температуре 37°С.
После транспортирования эмбрионов проверяют сохранность первоначального чередования воздуха и среды в каждой пайете (соломинке) и, если она не нарушена, помещают пайету в катетер и проводят пересадку.
Инструменты после пересадки одного эмбриона моют и дезинфицируют спиртом, орошают стерильной средой Дюльбекко, вставляют соломинку с эмбрионом, прибор помещают в чехол и проводят пересадку. При использовании устройств с эластичными капиллярами, дезинфицируют только зонд-направитель, а эластичный капилляр утилизируют. По окончании пересадки все использованные приборы и оборудование моют, дезинфицируют и готовят к следующему этапу работ.
3) Подготовка реципиентов
Подготовка реципиентов к пересадке эмбрионов осуществляется так же, как и при подготовке доноров для нехирургического извлечения зародышей:
-животных фиксируют в станке, наружные половые органы обмывают теплой водой с мылом, дезинфицируют 70%-ным этанолом, делают сакральную анестезию 2%-ным раствором новокаина (5 мл). Сильно возбудимым животным вводят релаксанты внутримышечно в дозе 0,5-0,8 мл;
-подготовленный к пересадке прибор (катетер) вводят во влагалище до шейки матки, вынимают защитный чехол и под ректальным контролем проводят катетер через цервикальный канал. При этом выполняют ректально те же манипуляции, что и во время введения катетера при нехирургическом извлечении эмбрионов. Осторожным движением катетер подвигают ближе к верхушке рога матки, ректально контролируя положение округлой головной части прибора. Убедившись в правильности расположения прибора, плавным нажатием на поршень устройства вводят содержимое соломины в просвет рога матки. Также плавным и осторожным движением прибор вынимают из полости матки.
- при использовании устройства для пересадки эмбрионов с эластичным капилляром (патент РФ на полезную модель №153867 от 09.07.2015г. «Устройство для сбора эмбрионов животных» (авторы Косовский Г.Ю., Попов Д.В., Бригида А.В.)) оператор вводит во влагалище зонд-направитель, удаляет защитный чехол, под ректальным контролем проводит зонд-направитель через
