контейнер и помещают в морозильную установку, в котором соломинки подвергаются автоматической заморозке начиная с +4°С до -140°С, под непосредственным контролем компьютерной программы. Во время заморозки на мониторе выводится калибровочная кривая хода заморозки. После достижения температуры спермы в соломинках -140°С, соломинки загружают в сосуд с жидким азотом предварительно поместив согласно номера быка в мешочки из капроновой ткани, на которые заносится номер и кличка быка, его породная принадлежность. Из полученной свежей спермы, а также по завершении замораживания, отбираются образцы спермы для проведения оценки качества спермы и ее бактериологической обсемененности, а после месячного карантина сперма проверяется на активность.
Сохранение высокого оплодотворяющего потенциала семени в процессе замораживания и размораживания требует соответствующих условий для криоконсервации. Многочисленные исследования в течение последних 50 лет были направлены на усовершенствование процессов замораживания и размораживания семени производителей.
Установлено, что специфический размер спермы, его форма, содержание мембранного липида, протеиновый состав, метаболические условия влияют на условия, предъявляемые к криоконсервации половых клеток.
Несмотря на успешные исследования по соверншенствованию криоконсервации, некоторые сперматозоиды не могут выжить в процессе замораживания и размораживания. Имеют место две основные причины гибели клеток или ущерба для них:
♦ образование кристалликов льда внутри сперматозоидов (внутриклеточное образование льда) при применении быстрого j темпа замораживания, который наносит непоправимый вред мембранам спермы;
♦ развитие районов высокой концентрации растворенного вещества (эффект растворимости), которые обезвоживают клетки при использовании медленного темпа замораживания или I размораживания.
Целью некоторых процедур по замораживанию спермы является оптимизация темпа замораживания, чтобы гибель клетки, вследствие внутриклеточного образования льда и гипертонических растворов была сведена до минимума. Индивидуальные процедуры обработки спермы в лаборатории по криоконсервации включают:
-
♦ темп замораживания;
-
♦ время уравновешивания;
-
♦ время уравновешивания - темп таяния;
-
♦ темп таяния - темп замораживания;
-
♦ темп замораживания - уровень глицерина;
-
♦ уровень глицерина — темп размораживания. В результате этих взаимодействий оценка' эффекта инди- видуальных составляющих процесса криоконсервации по жизнеспособности спермы может быть не точной. Поэтому, нет чет-; кого определения для «лучшего» наполнителя для спермы или методики обработки.
-
С самого начала развития техники криоконсервации спер- мы млекопитающих, глицерин, желток или молоко в большем части использовались как замороженные наполнители. Наполя нители, используемые для криоконсервации сперматозоидов быков, обычно содержат 20% желтка, а риск микробного зара! жения может иметь место.
IMV Techologies ввели новую концепцию криоконсерваЯ ции спермы быков: препарат Bioxcell ТМ, стерильный наполни! тель-желток, который был широко использован в центрах по ис| кусственному осеменению коров и телок во Франции. Подготовка наполнителя к использованию включае! следующие операции: К ♦ поместить бутылку со 100 мл концентрированного на! полнителя в водяную баню при температуре 32-34°С на 10 ми| нут;
-
♦ поместить 400 мл Erlemneyer дважды продистиллирован*
-
ной стерильной охлажденной воды или эквивалент в водянука баню при температуре 32-34°С;
♦ прилить 100 мл концентрированного наполнителя в 400 мл дважды продистиллированной охлажденной стерильной воды или эквивалента. Ополоснуть бутылку дважды окончательным раствором;
♦ гомогенизировать раствор - наполнитель готов к использованию
Рекомендуется использовать наполнитель для разбавления в течение 6 часов с момента его приготовления.
Один раз приготовленный наполнитель Bioxcell ТМ может быть заморожен при температуре минус -20 С, желательно сразу после ее приготовления, для дальнейшего использования. Приготовленный раствор нужно разделить на дозы по 100 мл.
Размораживание должно быть проведено быстро (опустить колбочки прямо в водяную баню при 32-34°С на 15 минут). Не следует вновь замораживать приготовленный гомогенизированный наполнитель.
Методика одноступенчатого разведения при температуре 32-34°С
Упаковка спермы при комнатной температуре (20 С) производится следующим образом:
-
♦ после анализа спермы делается предварительный раствор
-
1:1с помощью Bioxcell при 32-34°С;
-
♦ гомогенизируют колбу с раствором один раз;
♦ выдерживают в термостате предварительно разведенную сперму на водяной бане в течение 10 минут при температуре 3234 С и проводят окончательное разбавление, добавляя предварительно разведенную сперму в наполнитель (не гомогенизировать);
-
♦ бутылочки с разведенной спермой оставляют при ком
-
натной температуре на время от 10 до 15 минут;
♦ гомогенизируют и упаковывают сперму при температуре I 20 ’С. Концентрация спермиев в одной дозе (пайетгы объемом но 0,25 мл) должна быть не менее 15 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением (ППД);
