Комбинированные методы. Эти методы основаны на комбинации совершенно противоположных приемов обработки проб фекалий, то есть седиментации и флотации. Поэтому их называют седиментационнофлотационными. Несмотря на усложнение приемов обработки проб эти методы являются более эффективными, на исследования расходуются значительно меньше флотационной жидкости, следовательно, они более экономичны.
Благодаря комбинации противоположных приемов достигается обогащение осадка и поверхностной пленки яйцами гельминтов и удаление излишних посторонних частиц взвеси, которые мешают микрокопированию. Применение двойного центрифугирования взвеси вначале с водой, а затем с флотационным раствором способствует в первом случае быстрому осаждению яиц в результате воздействия центростремительной силы, а во втором – всплыванию их за счёт воздействия центробежной силы.
Впервые комбинированный метод гельминтоовоскопии был предложен американским паразитологом Дарлингом (1911). В последующем на основе этого метода были разработаны различные методики и модификации.
Метод Дарлинга. Пробу фекалий весом 3–5 г помещают в химический стаканчик и тщательно размешивают в 18–20 мл воды, процеживают через сито в другой стаканчик, полученную жидкость переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1–2 мин при 3000 об / мин. Затем надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют флотационную жидкость, состоящую из равных частей глицерина и насыщенного раствора хлорида натрия. Плотность такой жидкости равна 1,205 при температуре 18ºС. Содержимое взбалтывают и вновь центрифугируют в том же режиме. При этом яйца всплывают, их снимают проволочной петлей с поверхностной пленки и исследуют под микроскопом на предметном стекле. Этот метод применяют для диагностики аскаридатозов и других нематодозов у животных. Метод Щербовича . В качестве флотационных жидкостей автором предложены три раствора из насыщенных солей: натрия нитрата, магния сульфата и натрия тиосульфата.
Пробу фекалий величиной с грецкий орех кладут в стакан, добавляют 40 – 60 мл воды и тщательно размешивают до появления равномерной взвеси. При постоянном помешивании взвесь процеживают через металлическое сито или марлю в чистый стакан. После 5 минутного отстаивания надосадочную жидкость сливают. На дне оставляют такое количество взвеси, которое бы вместилось в центрифужную пробирку, и центрифугируют 1-2 мин при 3000 об / мин., после чего, всю жидкость до осадка сливают, а к осадку добавляют необходимый флотационный раствор. Осадок взбалтывают до получения взвеси и снова центрифугируют 1–2 мин при 1500 об / мин. После этого металлической
петлей снимают поверхностную пленку, переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.
При диагностике метастронгилеза свиней применяют насыщенный раствор магния сульфата (0,92 кг MgSO4 на 1 л воды, ρ–1,28). При этом выявляются яйца и других нематод, в частности, трихоцефал, аскарисов, стронгилят пищеварительного тракта различных животных.
Насыщенные растворы натрия тиосульфата (1,75кг Na2S2O3 на 1 л воды, ρ–1,38) рекомендуются для диагностики макраканторинхоза свиней, а также других гельминтозов животных. Методику можно применять так же и для диагностики тениидозов собак, спируратозов (тетрамероза, стрептокароза, эхинуроза и полиморфоза) водоплавающих птиц, используя эти растворы.
Недостатком этого метода со всеми тремя флотационными жидкостями является то, что с его помощью не удается диагностировать тяжелые яйца трематод, в частности описторхисов, фасциол и парамфистом.
Метод Котельникова-Вареничева. Яйца описторхисов очень мелкие и тяжелые (удельный вес 1,38–1,46). В связи с этим обычные флотационные растворы непригодны. В качестве флотационной жидкости в этой методике применяют насыщенный раствор хлорида цинка (2 кг ZnCl2 на 1л воды) с плотностью 1,82. Техника проведения этого метода аналогична методу Щербовича.
Метод предложен для диагностики описторхоза плотоядных, но он пригоден и для гельминтоовоскопии других трематод, а также нематод и цестод у животных.
Недостатком этого метода является то, что из-за большого удельного веса флотационной жидкости (1,82) вместе с яйцами гельминтов поднимаются на поверхность после центрифугирования и не переваренные частицы корма, что затрудняет просмотр материала и в конечном итоге влияет на диагностическую эффективность этой методики.
Разработано также много других модификаций комбинированного метода гельминтоовоскопии. В качестве флотационной жидкости предложены насыщенные растворы из следующих солей: нитрата аммония – 1,5 кг NH4NO3 на 1л воды, ρ–1,30 (метод Котельникова – Хренова), калия карбоната – 0,6 кг K2CO3 на 1л воды, ρ–1,41 (метод Вольфа), цинка сульфата – 0,45 кг ZnSO4 на 1л воды, ρ–1,39 (метод Вишняускаса). Одни из перечисленных методов сложны по технике выполнения, другие малоэффективны при трематодозах. По этой причине они также не нашли широкого применения на практике.
Модифицированный метод (Латыпов Д.Г. и др., 2002). Разработана новая модификация комбинированного метода гельминтоовоскопии. Техника её проведения аналогична методу Щербовича. В качестве флотационной жидкости применяется смесь из трех ингредиентов – насыщенных солей цинка хлорида, натрия хлорида и сахара.
Вначале готовят отдельно насыщенный раствор цинка хлорида (2кг ZnCl2 на 1л воды, ρ–1,82), насыщенный раствор натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л воды, ρ–1,19), и сахара (1,67 кг C12H22O11 на 1л воды, ρ–1,28). Для получения комбинированной флотационной жидкости смешивают эти растворы в соотношении 2:1:1. Плотность такого раствора составляет 1,53.
Модифицированный комбинированный гельминтоовоскопический метод является универсальным и позволяет диагностировать одновременно яйца нематод, цестод и трематод. Диагностическая эффективность метода высокая. По результативности он превосходит все вышеперечисленные методы гельминтоовоскопии животных. Поверхностная пленка после центрифугирования с флотационной жидкостью остается чистой, нанесенные капли не подвергаются кристаллизации в течение 3-х часов.
Экспресс – метод групповой гельминтоовоскопии (Латыпов Д.Г. и др., 2007; на метод получен патент на изобретение). С увеличением объема диагностических исследований существующие лабораторные методы распознавания гельминтозных заболеваний, основанные на ручном труде не удовлетворяют практические запросы.
В течение рабочего времени гельминтоовоскопически можно исследовать не более 40–50 проб (в среднем 10 мин. на пробу). Вместе с тем, из-за низкой диагностической эффективности гельминтоовоскопических методов при трематодозах (фасциолез, дикроцелиоз, парамфистоматоз и др.) не представляется возможность индивидуальной дегельминтизации, т. к. большинство инвазированных животных остаются не выявленными. По этой причине, при обнаружении в стадах зараженных животных в практических условиях рекомендуется применять групповую дегельминтизацию.
Исходя из вышеизложенного, экспресс – метод групповой гельминтоовоскопии животных, как позволяющий в минимальном отрезке времени определить паразитологическую ситуацию в стадах или отарах заслуживает особого внимания практиков. Эта методика удобна также при контроле диагностической эффективности антгельминтиков, особенно когда у животных встречаются ассоциативные формы инвазии. Экспресс метод проводится по следующей схеме:
С каждой пробы фекалий (от 10 до 100 проб) с помощью пинцета кладут примерно по 1г фекалий в банку емкостью 2 л. Затем взятые пробы заливают небольшим количеством воды и тщательно размешивают пинцетом или палочкой, при постоянном помешивании добавляют воду порциями до объема 2л. Взвесь фильтруют через металлическое сито с размером ячеек 0,5 х0,5 мм в другую банку емкостью 3 л, а оставшийся на сите осадок промывают добавлением 200–250 мл воды. После взвесь снова фильтруют через сито с размером ячеек 0,25х0,25 мм в чистую банку емкостью 3 л. Оставшийся на сите осадок повторно промывают добавлением 200–250 мл воды. Двукратно отфильтрованную взвесь
