ной азотной кислоты белковые растворы, имеющие в своем составе аминокислоты, дают характерное желтое окрашивание. Раствор смеси азотных солей окиси и закиси ртути окрашивает раствор, в котором есть тирозин, в кирпичный цвет (реакция Миллона). Триптофан обнаруживается реакцией Адамкевича, при которой добавление в раствор белка, содержащего эту аминокислоту, раствора глиоксиловой кислоты в серной кислоте дает темно-фиолетовое кольцо. Присутствие в белке аргинина можно установить по малиново-красному окрашиванию раствора при обработке его типохлоридом натрия, а затемВсе аминокислоты,раствором В-нафтолатакже как(реакцияи белки,Сакагуши).дают реакцию с нингидрином. Растворы аминокислот при этой реакции окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Существуют и другие специфические реакции для большинства амиHOKHCJIOT. Количественные методы хотя и трудоемкие, но дают более точное представление об аминокислотном составе изучаемого белка или ткани, позволяют более полно судить о некоторых их свойствах, дают сравнительную характеристику различных биологических объектов. Все имеющиеся методы количественного анализа амифические,нокислот можномикробнологические,разделить на химические,ферментативныехроматогра-и методы с применением изотопов. Химические методы чаще всего основываются Ha реакции окрашивания при взанмодействии химического реагента с аминокислотой. Чем интенсивнее окраска, тем более высокая концентрация конкретной аминокислоты в исследуемом материале. Сравнивая при помощи фотометра степень окраски используемого раствора со стандартным, определяют количество аминокислоты B пробе. Предложено много методов химического анализа. Наиболее известны и широко употребляются только некоторые из них, основанные на реакции с азотистой кислотой и нингидрином. В этой реакции аминокислоты, имеющие а-аминогруппу, при взаимодействии с азотистой кислотой образуют соответствующие оксикислоты с выделением азота по следующей схеме: R— Gees Е HNO, > R— ee Е № + НО. NH, OH 17
ИА
На основе этой реакции разработан нитритный метод. (Ван-Слайка) определения аминокислот по количеству выделяющегося азота. При реакции аминокислот с нингидрином образуется угольцый ангидрид и соответствующий альдегид, количество которых может быть определено.
Имеется ряд специфических реакций на отдельные аминокислоты. Гистидин и тирозин, например, определяют колориметрически в результате реакции с диазотидлярованпойопределениясульфаниловойкаждой изкислотойаминокислот(реакцияих.нужноПаули),раз-но делить. Триптофан определяется колориметрически на основе реакции с парадиметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) и нитритом натрия в кислой среде Метионин дает окрашивание с нитропруссидом в ИЛЬ. но щелочном растворе. Качественные методы определения содержания тирозина, аргиница, фенилаланина, триптофана также относятся к специфическим. В лабораторной практике только искоторые из химических методов количественного определения аминокислот паходят применение, так как остальные сравнительUO трудоемки, мало производительны и для них необходимы дефицитные реактивы. Наиболее доступны химифана, глицина. ческие методы определения лизина, метионина, триптоЛизин определяется на основании окрашивания в реакции с дипитрофторбензолом (ДНФБ). Интенсивжелтыйность окраскицвет эпсилондает (г)возможностьаминогруппыопределитьпри химическойсодерноежаниеколичестволизина. Этимэтой аминокислотыже методом определяютдля организмаи достун-животпых. Триптофан определяется на основании его свойства давать с парадиметиламинобензальдегидом окраску, инаминокислоты.теисивность которойНаиболеепропорциональначасто этот метод концентрациииспользуется в лабораторной практике, поскольку при кислотном гидролизе триитофан разлагается. Определить мегиопин можно по реакции его с питропруссидом натрия. Хроматографический метод определения аминокислот впервые предложен русским ботапиком М. С. Цветом в 1903 г. Метод оспован на принциие адсорбции. В послед-
ние два десятилетия он широко использовался для определения аминокислот.
Особенную популярность получили методы расиредедлительной хроматографии на бумаге и ионообменной хроматографии. Как правило, указанными методами онределяются постоянно встречающиеся аминокислоты в чистых белках, свободные аминокислоты, а также в различных биологических материалах и тканях (продукты растительного и животного происхождения, кровь, моча, молоко, шерсть и др.). Определение аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге основано на распределении их между двумя фазами — неподвижной {целлюлоза бумаги, пропитанная водой) и подвижной (не смешивающийся с водой растворитель). Молекулы аминокислот переносятся подвижной фазой в новое место, причем каждая аминокислота имеет свой коэффициент распространения, в результате чего опи располагаются на листе бумаги на различном расстоянии друг от друга. Схематично весь процесс сводится к выполнению следующих последовательных операции: подготовка ооразца к гидролизу, гидролиз белка или биологического объекта, подготовка гидролизата к анализу и нанесение его телей (хроматографирование), обработка хроматограмм на полоску бумаги, пропускание органических растворираствором нингидрина в ацетоне, элюция аминокислот, со стандартом и расчет содержания аминокислоты в установлениепробе и образце.экстинкцииПодготавливаетсяна фотометреобразеци сравнениек гидролизуее обезжириванием его, удалением углеводов (из высокоуглеводистых материалов), выделением суммарного белка. Чтобы ne допустить разрушения серусодержащих амипокислот (метионина, цистина, цистеина), в процессе гидролиза проводят оксидацию его надмуравьиной кислотоймуравьиной(1 мл кислоты,30%-ной смесьперекисивыдерживаютводорода9в млтечение88%-нойчаса при температуре 15—20°C, а затем охлаждают до 0°). В процессе оксидации цистин и цистеин окисляются до цистеиновой кислоты, а метионин — до метионинсульфона, которые устойчивы к воздействию 6 н. HCI. Наиболее ответственная и сложная операция в провсдении хроматографии — это гидролиз образца. Выбор оптимальных условий гидролиза является решающим
19
