К образцам крови прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, возраста, породы, родителей. Образцы крови хранят в холодильнике при температуре 2-4°С не более 1-2 недель.
1.3. Метод и правила определения антигенного спектра эритроцитов
Антигенный состав крови крупного рогатого скота определяют по результатам постановки серологических реакций с помощью моноспецифических сывороток реагентов.
Сущность реакции состоит в том, что антитела, содержащиеся в сыворотках-реагентах, соединяются с гомологичными антигенами эритроцитов крови исследуемого животного. Соединение антигена с антителом в присутствии комплемента (нормальной кроличьей сыворотки) вызывает разрушение оболочек эритроцитов (гемолиз) и освобождение гемоглобина, который окрашивает жидкость в красноватый («лаковый»). При отсутствии антигена реакция не происходит, эритроциты остаются неповрежденными и оседают на дно.
Подготовка материалов для постановки реакции гемолиза
Перед проведением иммунологической реакции необходимо подготовить к работе реагенты, суспензии эритроцитов, серологические тесты, штативы с пробирками и т.д.
Подготовка реагентов
-
Для размораживания реагенты переносят в лабораторное помещение с комнатной температурой. Для ускорения процесса флаконы можно поставить в теплую воду с температурой не выше 36 — 37°С.
-
Готовят рабочие титры в соответствии с маркировкой на флаконах. Сыворотки разбавляют физиологическим раствором на одну-две ступени ниже их предельного тира, указанного на флаконе. Например, если реагент имеет титр 1:32, то для работы его надо разбавить не более, чем в 16 раз.
Реагенты с рабочим титром должны быть использованы в течение одного дня. Неиспользованные реагенты замораживают, затем используют в течение ближайших двух-трех дней.
Подготовка комплемента
Перед постановкой реакции гемолиза размораживают необходимый объем комплемента, поместив стеклянный пузырек с ним в теплую воду (28-30°С).
Комплемент, оставшийся после постановки реакции, необходимо уничтожить, так как он резко теряет активность и приходит в негодность при повторном замораживании.
Приготовление суспензии эритроцитов
Для постановки серологических реакций необходимо приготовить 2,5%-ную суспензию эритроцитов из образцов крови исследуемых животных. Техника приготовления суспензий состоит из следующих операций.
- Трехкратное отмывание эритроцитов.
Отмывание эритроцитов производят физиологическим раствором (0,85%-ный раствор хлористого натрия при pH = 6 ,7-7,0) для удаления белков: на чистые центрифужные пробирки наносят номера образцов крови; в каждую пробирку вносят 1,5-2 мл хорошо перемешанной консервированной крови и 7-8 мл физиологического раствора; перемешивают содержимое пробирки путем осторожного переворачивания и центрифугируют при 2000-2500 мин' 1 в течение 5-7 мин; водоструйным насосом удаляют надосадочную жидкость и верхний слой эритроцитов с белой пленкой (оставшиеся белки); к осадку эритроцитов вновь добавляют физиологический раствор и проводят повторное отмывание не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет светлой и прозрачной.
- Приготовление стандартной суспензии. В пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора. Вносят 2,5 мл отмытых эритроцитов любого образца, предварительно перемешав их легким встряхиванием. Содержимое пробирки перемешивают, переворачивая 5-6 раз.
Полученная 2,5%-ная суспензия эритроцитов является эталоном (стандартом) для приготовления рабочих суспензий.
- Приготовление 2,5%-ной рабочей суспензии эритроцитов. На чистые пробирки наносят номера отмытых образцов крови. В каждую пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора и вносят каплями отмытые эритроциты соответствующего образца.
Готовят 2,5%-ную суспензию путем сравнения со стандартом по интенсивности окраски.
Суспензию можно хранить пять-шесть дней при температуре 2- 4°С.
Подготовка бланка серологического теста
Серологический тест — это основной рабочий документ при тестировании животных по группам крови, в котором фиксируются результаты серологических реакций. Бланк теста заполняют перед постановкой реакции (кроме результатов читки). В шапке документа указывается:
хозяйство, из которого поступили образцы крови;
порядковый номер теста;
дата постановки реакции;
время начала отдельных операций при постановке реакции.
В левой полосе записывают номера образцов крови, индивидуальные номера и клички животных, у которых определяют тип крови.
В верхней полосе слева направо вписывают наименования реагентов (с указанием их титра) строго по-системно, согласно алфавиту (А, В, С, F, J, L, М, S, Z, R-S').
Правила постановки реакции гемолиза для определения эритроцитарных антигенов
Выявление антигенов эритроцитов крупного рогатого скота производят путем постановки реакции гемолиза.
Принцип реакции заключается в связывании антитела с антигеном в присутствии комплемента, в результате чего происходит гемолиз эритроцитов и выход гемоглобина в жидкую фазу с окрашиванием ее в красноватый цвет.
Степень гемолиза отмечают в протоколе (серологическом тесте) при первом и втором чтениях реакции.
Техника постановки реакции гемолиза
Реакция гемолиза проводится в блоках или пластинах из прозрачного оргстекла с круглыми глубокими ячейками (гнездами), предназначенными для внесения и смешивания компонентов, участвующих в реакции.
