5М NaCl. Растворяют 292,2 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.

1М MgCl2. Растворяют 203,3 г MgCl2 х 6Н20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. MgCL 2 гигроскопичен.

ЗМ ацетат натрия р№=5,2. Растворяют 408,1 г ацетата натрия х ЗН20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.

1М дитиотрейтол (DTT). Растворяют 3,09 г DTT в 20 мл 0,01М ацетата натрия рН=5,2. Стерилизуют фильтрованием, разливают на порции по 1 мл и хранят при -20°С.

называемый также 10%-ный додецилсульфат натрия (SDS )， лаурилсульфатом натрия. Растворяют 100 г химически чистого SDS в 900 мл дистиллированной воды. Нагревают до температуры 6 8 °С, чтобы ускорить растворение. Доводят pH до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной НС1. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции. Раствор не стерилизуют.

Бромистый этидий, 10 мг/мл. Добавляют 1 г бромистого этидия к 100 мл дистиллированной воды. Размешивают на магнитной мешалке несколько часов, пока краситель не растворится. Завертывают колбу в алюминиевую фольгу или переливают в темную склянку и хранят при температуре 4°С. Бромистый этидий — мутаген (работают в перчатках).

Растворы ферментов протеиназы К и РНКазы А. Растворить сухую панкреатическую протеиназу К в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Концентрация в реакции 0,2-0,5 мг/мл. Температура реакции 37°С. Предварительная обработка фермента не требуется. Хранить при температуре -20°С.

Растворить панкреатическую РНКазу А в концентрации 10 мг/мл в дистиллированной воде или в 10 мМ Трис-Нс1, pH 7,5 и 15 мМ NaCl. Прогрейть 10 мин при температуре 95-100°С для разрушения ДНКазы и медленно охладить до комнатной температуры. Разлить на порции, хранить при -20°С. Концентрация в реакционной смеси 0 , 1 мг/мл.

Выделение ДНК из крови К 3-5 мл крови добавляют по капле, непрерывно помсши вая, 40-60 мл охлажденного 0,1 мМ ЭДТА; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 15-20 мин с охлаждением (тип центрифуги K70D или K23D), осаждая ядра лейкоцитов; удаляют супернатант; осадок, состоящий из ядер лейкоцитов, отмывают рядом следующих друг за другом ресуспендирований и центрифугирований в буфере 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8) до исчезновения примеси гемоглобина; центрифугируют при 3000 мин' 1 15-20 мин с охлаждением; отмытый осадок ядер лейкоцитов подвергается лизису. Для этого к осадку добавляют lxSTE буфер (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8, 100 мМ NaCl), 10% SDS до конечной концентрации 1%, протеиназу К до конечной концентрации 200-500 мкг/мл; лизирование ядер лейкоцитов проводится при комнатной температуре в течение ночи; лизат обрабатывают РНКазой в течение 1 ч при температуре 37°С для разобщения ДНК с РНК, добавляя фермент до конечной концентрации 1 0 0 мкг/мл; проводят экстракцию ядерной ДНК из лизата фенольнохлороформным методом. Для этого к полученному объему лизата добавляют равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола; тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; если органическая и водная фаза хорошо разделились, соберите водный слой (если недостаточно, то центрифугируйте еще раз более продолжительное время или при большей скорости). Промежуточную и нижнюю органическую фазы отбросить; добавляют к собранной водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1); тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; отсасывают пипеткой водную фазу;

добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1); тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; отсасывают пипеткой водную фазу; осаждают ДНК этанолом, добавив два объема охлажденного 95%-ного этанола к объему полученного раствора ДНК; перемешивают переворачиванием; если ДНК выделилась сразу в виде “медузы”，то ее переносят в 70%-ный спирт с помощью пипетки с расширенным носиком; переносят выделенную ДНК в чистую микроцентрифужную пробирку;

высушивают ДНК на воздухе, стараясь не пересушить; высушенную ДНК разбавляют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде. Объем буфера или дистиллированной воды выбирают в зависимости от количества ДНК.

Выделение ДНК из ткани

0 , 1 г ткани измельчают ножницами, перекладывают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют два объема буфера 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8);

в пробирку добавляют 10% SDS (додецилсульфат натрия) до 1%-ной концентрации, протеиназу К (20 мг/мл) до концентрации 200 мкг/мл. Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч. Можно проводить лизис при температуре 37°С в течение ночи;

добавляют к лизату РНКазу (10 мг/мл), свободную от ДНКаз, до концентрации 100 мкг/мл и инкубируют лизат 1 ч при температуре 37°С. Центрифугируют при 3000 мин' 1 10 мин;

к супернатанту добавляют равный объем фенола (pH 8 ), перемешивают, центрифугируют при 6000 мин' 1 1 0 мин;

добавляют к водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1), центрифугируют в том же режиме. Собирают водную фазу; добавляют равный объем хлороформа (смесь хлороформа с изоамиловым спиртом 24:1), центрифугируют, отбирают водную фазу. Эту стадию повторяют до исчезновения белой интерфазы;