5.3. Правила и методы проведения цитогенетического анализа

Цитогенетический анализ животных проводят в несколько этапов:

культивирование лимфоцитов для получения достаточного количества клеток на стадиях ранней метафазы, метафазы;

фиксация клеток и приготовление препаратов хромосом; окраска препаратов хромосом;

анализ препаратов хромосом, кариотипирование;

заключение о генетическом состоянии животного.

Культивирование лейкоцитов периферической крови

Постановка культуры клеток

Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.

Во взятой крови осаждают эритроциты центрифугированием в течении 5-10 мин при скорости 1000 мин'1. Образовавшийся слой лейкоцитов и плазму собирают и переносят во флаконы. Для культивирования лейкоцитов во флаконы добавляют по 5-6 мл культуральной среды, содержащей митоген, в пропорции, соответствующей типу и марке митогена, и антибиотики.

При культивировании лейкоцитов свиней в качестве митогена используют фитогемагглютинин. Для некоторых видов крупного рогатого скота, лошадей, кроликов целесообразнее использовать конконовалин А или смесь нескольких митогенов. При культивировании лейкоцитов обычно используют смесь пенициллина со стрептомицином из расчета 50-100 МЕ/мл.

Флаконы с клетками в культуральной среде плотно закрывают крышками и помещают в термостат при температуре 37,5-38,539,0°С на 72 ч.

Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.

За 1-3 ч до окончания культивирования в каждый флакон добавляется колхицин из расчета 0,35 мкг на 1 мл культуры

39

(обычно используют маточный раствор с концентрацией 0 , 1 мг/мл). Завершение культивирования колхицинированных клеток проходит в термостате при заданной температуре.

Все последующие обработки клеток выполняют без соблюдения условий стерильности.

По окончании культивирования взвесь клеток центрифугируют в течение 5-10 мин при 1000 мин"1. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,075 М КС1, затем клетки подвергают гипотонической обработке в течение 5-15 мин при температуре 38°С, или 30-55 мин при комнатной температуре.

Фиксация клеток

После гипотонической обработки суспензию клеток центрифугируют в течение 1 0 мин при 1 0 0 0 мин'1, надосадочную жидкость удаляют, осадок фиксируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе — смеси метанол-уксусная кислота (3:1). Клетки ресуспендируют в фиксаторе, затем центрифугируют в течение 10 мин. Фиксацию проводят 2-3 раза. Зафиксированные клетки ресуспендируют и хранят в фиксаторе в холодильнике. Сохранять зафиксированные клетки перед приготовлением препаратов можно в течение 1-3 дней. Увеличение срока хранения приводит к ухудшению качества метафазных пластинок на препаратах.

Приготовление препаратов хромосом

Перед приготовлением препаратов необходимо поменять в пробирках фиксатор. Зафиксированные клетки тщательно ресуспендируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе. Несколько капель клеточной суспензии с помощью пастеровской пипетки наносят на предметное стекло. Предметные стекла для хромосомных препаратов должны быть тщательно вымыты и затем обезжирены в растворе хромпика. Перед приготовлением препаратов стекла тщательно промываются в проточной воде и затем в нескольких сменах дистиллированной воды. Отмытые стекла охлаждают в дистиллированной воде в холодильнике.

Клеточную суспензию раскапывают на мокрое и холодное стекло и высушивают при комнатной температуре. От одного животного готовят, по возможности, от четырех до десяти стекол. Готовые препараты хранят в плотно закрытых коробках при комнатной температуре или в холодильнике, в зависимости от дальнейших обработок.

Окраска и анализ препаратов хромосом

Окраска препаратов хромосом

При анализе кариотипа сельскохозяйственных животных используют несколько типов окраски хромосом. Рутинная окраска, при которой хромосомы окрашены однородно, позволяет провести первоначальный анализ хромосомного набора животного. При обнаружении каких либо нарушений структуры или количества хромосом в наборе необходимо проводить более детальный анализ, используя методы дифференциального окрашивания. Наиболее приемлемыми вариантами дифференциальной окраски для генетической экспертизы являются G-окраска и R-окраска, позволяющие выявить четкую дисковую исчерченность строго специфичную для каждой хромосомы.

Рутинная окраска

Для рутинного анализа хромосом на световом микроскопе препараты окрашивают азур-эозином по Романовскому или красителем Г имза. Для этого препараты помещают на 6-10 мин в 2%-ный раствор красителя Г имза в фосфатном буфере ( Na 2 Н Р04 : КН 2 РО 4 ), pH 6 ,8 . Контроль окрашивания проводят под микроскопом. Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой и высушивают. Анализировать с помощью микроскопа можно только полностью высушенные препараты, используя объективы 25 и 90.

Дифференциальная окраска G-mun

G-окраска может выполнятся несколькими методами. Наиболее приемлемым является метод Раджабли и Крюкова (1973), разработанный на основе методов Seabright (1971) и Evans et al.