ДНК из водной фазы осаждают двойным объемом 95%ного этанола, дважды промывают 70%-ным этанолом, подсушивают на воздухе и растворяют в таком объеме воды, чтобы концентрация ДНК составила примерно 0,5 мкг/мл.
Выделение ДНК из спермы
_ Небольшое количество спермы объемом не более 20 мкл промывают буфером (100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (pH 8 ) для освобождения от семенной жидкости;
осаждают центрифугированием при 1 0 0 0 0 мин" 1 на микроцентрифуге в течении 5 мин;
лизис препарата проводят в лизис-буфере объемом 700 мкл (состав буфера ЮмМ DTT, 1% SDS, 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, pH 8 с добавлением протеиназы К до конечной концентрации 1 мг/мл) при температуре 55-60°С в течение ночи. Причем в течение первого часа инкубации препарат тщательно перемешивают встряхиванием каждые 5 мин;
проводят экстракцию водной фазы поочередно: равным объемом фенола, смесью равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом (25:24:1), смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), дважды эфиром;
для осаждения ДНК к водной фазе добавляют 0,7 объема изопропанол;
-
центрифугируют при 1 2 0 0 0 мин" 1 в течение 1 0 мин;
-
осадок растворяют в 1 0 0 - 2 0 0 мкл воды;
-
добавляют ЗМ ацетат натрия до концентрации 0,ЗМ;
-
_ осаждают ДНК 2,5 объемами 95%-ного этанола;
-
осадок промывают 70%-ным этанолом;
-
переосаждают центрифугированием;
-
растворяют в воде.
Примечания. 1. Для лизирования ядер лейкоцитов, полученных из крови, и разрушения белков, связанных с ДНК, достаточно использовать 10% SDS. Для качественного выделения ДНК из кожи необходимо использовать оба фермента 一 протеиназу К и РНКазу. Объем лизата выбирается в зависимости от количества осадка с ядрами лейкоцитов (в пределах 0,75-2 мл).
- Если при экстракции ядерной ДНК из лизата белая интерфаза достаточно большая, сс нужно вновь экстрагировать.
-
Органическую и водную фазы при выделении крупных ДНК (>20 kb) нужно смешивать осторожным качанием, переносить ДНК из одной пробирки в другую следует пипеткой с расширенным носиком.
-
Если ДНК сразу не выделилась, необходимо охладить раствор до -20°С и выдержать при этой температуре 30-60 мин. Если ДНК присутствует в небольших количествах (меньше 0,1 мкг/мл), необходимо увеличить время охлаждения или понизить температуру до -70°С. Центрифугируют при температуре +4°С. Удаляют надосадочную жидкость. ДНК высушивают на воздухе и растворяют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде.
Проверка ДНК на концентрацию, нативность, подвижность
Концентрацию и нативность ДНК определяют в 1%-ном агарозном геле электрофоретическим методом.
К 2-5 мкл выделенной ДНК добавляется соответствующее количество десятикратного буфера (0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол, 25% фикол) до однократной концентрации. Приготовленный препарат ДНК вносят в лунки геля. Электрофорез проводят при напряжении 40-60 В в течение 1-2 ч. Визуализируют ДНК на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм. Концентрацию оценивают по яркости свечения полосы высокомолекулярной ДНК в геле в сравнении с известной концентрацией маркерной ДНК. О нативности (отсутствие деградации) ДНК свидетельствует отсутствие шлейфа. ДНК должна выйти из лунки в гель (подвижность). Наличие примесей РНК проявляется в виде пятен в низкомолекулярной зоне.
Амплификация фрагмента гена В LAD (метод ПЦР)
Используют праймеры: 5'-TGAGACCAGGTCAGGCATTGCGTTCA3, (сенс-праймер) и S’-CCCCCAGCTTCTTGACGTTGACGAGGTW (антисенс-праймер), позволяющие получать ПЦР-продукт длиной 132 п.н.
ПЦР проводят в объеме 25 мкл с 50-100 нг геномной ДНК. Реакционная смесь содержит также 50 мМ КС1; 10 мМ Tris, pH 8,4; 2 мМ MgCl 2； 25 пкМ праймеров; 100 мкМ каждого dNTP и 1 ед. акт. Т aq-пол имеразы.
Реакционную смесь без dNTPs прогревают 3 мин при температуре 93°С, добавляют dNTPs и проводят амплификацию в следующих условиях: при 93°С — 60 с, при 62°С 一 60 с, при 72°С — 50 с, 35 циклов.
Оценка результатов ПЦР
Концентрация и специфичность амплификата (фрагмент гена BLAD) оценивается электрофоретическим методом в 2%-ном агарозном геле, при напряжении 40 В в течение 1 ч.
Для идентификации амплифицированного фрагмента, полученного из 100 нг геномной ДНК, достаточно нанести на гель 5 мкл амплификата, смешанного с 1 мкл 1 0 х буфера для нанесения проб на гель.
Визуализируют амплифицированный фрагмент с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм. В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной Alul. Амплифицированный фрагмент гена BLAD имеет яркое, четко видимое свечение. Длина фрагмента составляет 132 п.н., он располагается в геле между полосами маркера 226 и 1 0 0 п.н.
Анализ амплификатов на наличие мутации
гена В LAD
Продукты ПЦР делят на две части. Одну аликвоту обрабатывают TaqI, другую — НаеШ. Электрофорез проводят в 4-5%-ном агарозном геле.
В реакционную смесь вносят:
2 мкл 1 0 х буфера для данной рестриктазы;
1 мкл фермента;
BSA до конечной концентрации 0,1 мг/мл;
5 мкл амплификата;
объем доводится водой до 2 0 мкл.
Реакционную смесь ставят на ночь в термостат при температуре 37°С.
Фрагменты рестрикции разделяются электрофоретическим методом при напряжении 40 В в течение 2 ч.
В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой Alul.
