| Ин декс | Наименование | Фенотип | Продолжение пш()л. 2 Тип насле дования |
|---|---|---|---|
| А3 9 | Атрезия под вздошной кишки (Atresia ilei) | Непроходимость подвздошной кишки, укорочение срока стель ности | Простой ре цессивный |
| А4 0 | Пробатоцефалия | “Баранья голова”， полулеталь ность, смерть в результате хро нической тимпании или нару | Простой до минантный с неполной |
| шения сердечной деятельности | пенетрантно- стью или рецессивный | ||
| A41 | Расщепление по звоночника | Насечки на грудных и пояснич ных позвонках. Мертворожде ния | Рецессивный |
| А4 2 | Выкидыш | Выкидыш в середине беремен ности | Простой ре цессивный |
| А4 6 | Паракератоз | Генетически обусловленное нарушение обмена цинка. Обра зование на коже чешуек и струпьев | То же |
4. Метод генной диагностики мутации В LAD крупного рогатого скота
Генетическая диагностика основана на идентификации фрагмента гена BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency — дефицит адгезивности лейкоцитов крупного рогатого скота), ответственного за состояние иммунной системы, из генома животного. Идентификация осуществляется с помощью специфических праймеров или затравок, ограничивающих данный фрагмент. Ген BLAD может содержать в своей структуре точковую мутацию, являющуюся причиной иммунодефицита, предрасположенности животных к респираторным инфекциям, диарее и низкой естественной резистентности организма к бактериальным инфекциям. Носи гели мутантного гена в гомозиготе не поддаются лечению. Наличие му тации в выделенном фрагменте определяется с помощью спсцифн ческого фермента, реагирующего на измененный мутацией фр;и мент.
Генетический тест включает в себя следующие этапы:
взятие проб биологического материала для тестирования (кровь, ткань или сперма);
выделение и оценка качества ДНК; проведение амплификации (метод ПЦР — полимеразная цепная реакция) фрагмента гена BLAD и оценка качества амплификата; обработка полученного продукта специфическими ферментами (метод ПДРФ — полиморфизм длин рестриктных фрагментов); оценка результатов реакции.
Реактивы
-
Трис-(оксиметил)-аминометан (ЫН2 С(СН2 ОН)з).
-
2 . Этилендиамин-М，!^，]^，! ^ — тетрауксусной кислоты динатрие-
-
вая соль, 2 — водная (Трилон Б, ЭДТА; C 10HMN 2Na2 O 8 .2 H 2 O).
-
Натрий хлористый (NaCl).
-
Магний хлористый шестиводный (MgCl2 *6 H2 0 ).
-
Додецилсульфат натрия (додециловый эфир серной кислоты
натриевая соль, натрия лаурилсульфат SDS; CH 3(CH2)i iOS0 3Na).
-
6 . Бромистый этидий (ethidium bromide или homidium bromide).
-
Концентрированная соляная кислота.
-
8 . Гидроокись натрия (NaOH).
9. Фенол (СбН5ОН).
-
Ацетат натрия CH 3COONa.
-
Борная кислота (НВОз).
-
Ферменты:протеиназа К, РНКаза А.
-
Набор для амплификации:
-
a) реакционный 1 Охбуфер;
-
b) фермент Tag-полимераза;
-
-
c) смесь, состоящая из четырех дезоксирибонуклеотидов
-
(A T G C)，или каждый из нуклеотидов может быть представлен в наборе по отдельности;
-
d) минеральное масло (можно заменить вазелиновым).
-
Все реактивы можно приобрести отдельно, не в наборе.
-
Праймеры или затравки для синтеза нужного фрагмента ДН. 15. Рестриктазы TagI, Haelll с соответствующем буфером. Хорошая активность ферментов наблюдается в присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA) в концентрации 0,1 мг/мл.
-
Цитрат натрия.
- Гепарин. 18. Сахароза.
Правила получения и хранения биологического материала
Ген BLAD-синдрома выделяют из проб крови (3-5 мл), кожи 2 (площадью приблизительно 0,1 см или 0,1-0,3 г) или спермы ( 2 0 мкл).
Образцы крови необходимо консервировать одним из консервантов:
гепарин — 0 , 0 1 мл на пробирку;
цитрат натрия — 1,5 мл на пробирку раствора следующего состава:
цитрат натрия 50 г сахароза 0,5 г дистиллированная вода до 1 0 0 0 мл
Кусочки кожи и сперму не консервируют.
Образцы крови, кожи，спермы транспортируют в охлажденном виде при температуре от 0оС до +4°С в течение одних суток.
Образцы хранятся при температуре -20°С в течение одного месяца.
Приготовление основных растворов
1М Трис-HCl рН=7,6. Растворяют 121,1 г трис-HCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до необходимого значения добавлением концентрированной соляной кислоты. Для достижения pH 7,6 необходимо добавлять постепенно при перемешивании приблизительно 60 мл концентрированной НС1. При этом постоянно измерять значение pH pH-метром или универсальной индикаторной бумагой (pH 0-12). Перед окончательным доведением pH дают раствору остыть до комнатной температуры. Доводят объем раствора до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
0,5М ЭДТА, рН=8,0. Добавляют 186,1 г двухзамещенной соли ЭДТА х 2Н20 к 800 мл дистиллированной воды. Интенсивно размешивают на магнитной мешалке. Доводят постепенно pH до 8 с помощью концентрированного раствора NaOH, не забывая постоянно проверять значение pH. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. Динатриевая соль не растворяется до тех пор, пока pH раствора не будет доведен добавлением NaOH приблизительно до 8 .
