6 . 7%-ная уксусная кислота:
уксусная кислота 70 мл вода до 1 0 0 0 мл 7. Раствор красителя кумасси R 250* 1 г 7%-ная уксусная кислота 1 0 0 мл
Перед употреблением этот раствор разбавляют 7%-ной уксусной кислотой 1 : 1 0 0 .
8 . Смесь для отмывки:
этиловый спирт, вода, уксусная кислота в соотношении 10:10:1 или 5:5:1. Смесь для отмывки можно заменить 7%-ной уксусной кислотой.
Методика постановки электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
Приготовление ПААГа
Необходимую концентрацию геля готовят так, как указано в табл. 1. Необходимо строго соблюдать последовательность и количество добавления компонентов.
Таблица 1
Схема приготовления ПААГа различной концентрации
| № | Компоненты | Концентрация геля, | % | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| п/п | 5 | 7,5 | 8 | 1 1 0 | 1 1 | 1 12,5 | |
| 1 . | 2 0 %-ный акрила мид, мл | 2 0 | 30 | 32 | 40 | 44 | 50 |
| 2 . | Г елевый буфер, мл | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 3. | ТЕМЭД, мкл | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 |
| 4. | Вода, мл | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 |
| 5. | Персульфат NH4, мл | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
Указанные соотношения компонентов рассчитаны на общий объем геля 80 мл. Если для работы необходимо большее или меньшее количество геля, то соотношение компонентов следует пересчитать на нужный конечный объем.
- Кумасси R 250 можно заменить амидочерным 10 Б.
Техника проведения электрофореза
-
Приготовить камеры для заливки геля. Способ сборки камер указан в инструкциях предприятий-изготовителей.
-
Приготовить 10%-ный гель (см. табл. 1) непосредственно перед заливкой камер.
-
Гель заливают в камеры с помощью стеклянного стаканчика с носиком. Во избежание образования воздушных пузырьков эту процедуру проводят следующим образом: камеру слегка наклоняют (от себя), кончик стакана прислоняют к стеклянной пластине камеры и медленно заполняют камеру гелем примерно на 3/4 объема. Затем на гель наслаивают дистиллированную воду. Г ель оставляют для полимеризации в течение 20-40 мин. при комнатной температуре. Заполимеризовавшийся полиакриламид слегка опалесцирует. После полимеризации воду слить.
-
Приготовить 5%-ный гель (см. табл. 1) и залить камеры до верха. Вставить гребенки.
-
Гель оставляют для полимеризации. При медленной полимеризации геля в зимнее время используют термостат.
6 . После успешной полимеризации нижнюю часть камеры разгерметизируют для свободного контакта геля с анодным буфером.
- Камеры с гелем вставляют в поддоны (при необходимости камеры специально закрепляют) и заливают охлажденные электродные буферы таким образом, чтобы конец гелевой пластинки с гребенками находился в катодном буфере, а противоположный конец — в анодном.
8 . Вынимают гребенки.
-
В ячейки автоматической пипеткой наносят по 5-10 мкл исследуемых образцов, оттитрованных 40%-ной сахарозой с индикатором 1 :2 .
-
Подключают источник питания.
-
Проводят электрофорез в два этапа:
1) при напряжении 100 В — 20 мин,
2) при напряжении 230-250 В в течение 1,5-2 ч.
-
Отключают источник питания.
-
Электродные буферы сливают в емкость и ставят в холодильник. Этот раствор используют в качестве анодного буфера в следующем электрофорезе.
-
Камеру разбирают до гелевых пластинок.
-
При необходимости удаляют лишние участки геля (ячейки и т.п.)
-
Отмечают начало геля, отрезая уголок гелевой пластинки со стороны начала нанесения проб. Когда гель находится вне камеры, легко перепутать начало геля, поэтому возможен другой способ. В последнюю ячейку не наносить образец — в этом случае пустая дорожка на геле будет маркировать конец нанесения проб.
-
Г елевую пластинку переносят в кювету с раствором красителя.
-
Г елевые пластинки помещают в раствор Кумасси на ночь для окрашивания.
-
На следующее утро краску сливают.
-
Г елевые пластинки промывают дистиллированной водой и заливают смесью для отмывки.
-
Смесь для отмывки меняют несколько раз.
-
Идентифицирование генотипов (чтение фореграмм) проводят на хорошо отмытых от фона пластинках геля над лампой искусственного освещения, закрытой матовым фильтром.
-
Результаты вносят в рабочий журнал и выходные документы. Для избежания ошибок или выяснения их причин необходимо рабочий журнал вести с особой тщательностью, отражая в записях постановки методики не только все непредвиденные изменения, но и реальную информацию о режиме проведения электрофореза (напряжение, время), концентрации гелей, pH буферов, титры и количества нанесения образцов и другое, а также в рабочем журнале должен быть отражен календарь приготовления растворов и фирмы-изготовители реактивов.
2.4. Определение генотипов животных по полиморфным белкам
Трансферрин у крупного рогатого скота представлен четырьмя аллелями. На гелевой пластинке (фореграмме) аллели расположены по мере снижения электрофоретической подвижности в следующем порядке: Tf A, Tf Db Tf D2, Tf E (у аллеля Tf А максимальная скорость миграции). Г омозиготы имеют по три полосы, гетерозиготы представляют собой совмещенную картину гомозиготных составляющих (рис. 1 ).
