(1971). Препараты на 10-60 с помещают в 0,25%-ный раствор трипсина, нагретый до температуры 35°С. После обработки трипсином препараты отмывают в буфере 2-SSC (0,6 М NaCl — 0,06 М цитрат натрия), переносят в чашку Петри со свежей порцией того же буфера, и инкубируют в течение 1 ч при температуре 62°С. После инкубации препараты прямо из буфера переносят в раствор красителя Г имза, приготовленного следующим образом: 2 мл основного красителя разводят в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл 0,1% Na2 Co3 . Препараты окрашиваются в вертикальном положении в течение 5-15 мин при контроле под микроскопом. После окрашивания препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Хромосомный анализ проводят на световом микроскопе при увеличении 90х, используя стандартные карты G-исчерченных хромосом.
Дифференциальная окраска R-muna
Дифференциальная сегментация хромосом R-типа по своей картине в точности противоположна G-сегментации: негативные диски при G-окраске соответствуют позитивным дискам при R- окраске. Варьируя температуру или pH среды при обработке препаратов, можно добиться перехода G-окрашивания в R- окрашивание. Вместе с тем R-окрашивание представляет интерес, а в ряде случаев более информативно, поскольку в отличие от G- метода интенсивно окрашиваются терминальные участки хромосом. Это позволяет получить отчетливо обозначенные концы хромосом, что важно при описании делеций и точек разрывов в хромосоме при транслокациях.
Среди ряда методов R-окрашивания наиболее информативным является RBA метод с использованием акридинового оранжевого. Принцип этого метода заключается в преимущественном окрашивании участков хромосом содержащих тимидин. Для этого за 7 ч до завершения культивирования, то есть во вторую половину s-фазы цикла клеточного деления, в культуру вводится бромдезоксиуридин (БДУ) в конечной концентрации 25 мкг/мл, который встраивается в поздно реплицирующие участки хромосом.
Для получения максимального числа дисков на хромосомах и хорошо различимого чередования позитивных и негативных дис- 42
ков целесообразнее использовать для дифференциального окрашивания не метафазные, а профазные и прометафазные хромосомы. Для этого за 1-3 ч до завершения культивирования вместе с колхицином во флаконы необходимо ввести этидиум бромида в конечной концентрации 10-15 мкг/мл. Это позволяет накопить в культуре клетки, находящиеся преимущественно на ранних стадиях митоза.
Препараты для получения данного типа окрашивания высушиваются на воздухе, без применения высокой температуры, и выдерживаются при комнатной температуре в течение 1 0 - 1 2 дней для лучшего окрашивания хромосом.
Готовые препараты окрашиваются 0 ,2 %-ным раствором акридинового оранжевого на ОД М фосфатном буфере (pH 7,0) в течение 1-3 мин под покровным стеклом. Затем стекла промываются проточной дистиллированной водой.
Анализ препаратов с R-дифференциальной исчерченностью проводится на флуоресцентном микроскопе при увеличении 25х и 90х используя стандартные карты R-исчерченных хромосом.
Анализ препаратов хромосом
Анализ препаратов хромосом проводят на световом или люминесцентном (в случае использования дифференциальной окраски хромосом) микроскопе визуально при увеличении 25х и 90х, а также на микрофотографиях.
Визуальный анализ хромосом
Для визуального анализа препаратов хромосом применяют рутинную окраску по Г имза.
Метафазные пластинки для хромосомного анализа (как визуального анализа, так и для кариотипирования) должны соответствовать ряду требований. На стекле выбирают метафазные пластинки только округлой формы, с хорошо заметной границей кариоплазмы. Хромосомы должны быть равномерно распределены внутри метафазной пластинки, не должны иметь накладок и выбросов за пределы кариоплазмы. Вблизи анализируемой метафазной пластинки не должно быть единичных хромосом или групп из нескольких хромосом. Степень спирализации хромосом должна по
зволять достоверно идентифицировать самые маленькие хромосомы набора.
При первоначальном анализе (используется рутинная окраска по Романовскому-Гимза) в 30-40 метафазных пластинках, визуально подсчитывают число хромосом. На этом этапе подсчитывают модальное число хромосом, определяют маркерные хромосомы и генетический пол животного по составу половых хромосом. Затем фотографируют несколько типичных метафазных пластинок. На микрофотографиях проводят анализ кариотипа и подтверждают данные первоначального визуального анализа. В случае, если возникает подозрение на присутствие конституциональных аномалий или значительных спонтанных изменений кариотипа, фотографируют от 30 до 50 метафазных пластинок.
Микрофотографирование препаратов хромосом
Микрофотографирование проводят на фотопленку микрат Орто (микрат 200) или микрат 300 (в зависимости от применяемой окраски хромосом). Для проявления фотопленок и печати фотографий используют стандартные проявители и закрепители.
На основании визуального анализа дают следующие характеристики животного: модальное число хромосом; генетический пол; наличие или отсутствие конституциональных нарушений кариотипа (транслокаций, центрических слияний, делеций и инверсий хромосом); частоту гипо- и гиперплоидных клеток; частоту полиплоидных клеток; частоту клеток со спонтанными структурными аберрациями хромосом.
Эти характеристики позволяют с высокой степенью точности оценить генетическое состояние животного, наличие или отсутствие у него генетического груза и племенной ценности.
При наличии у животного конституциональных аномалий хромосом, а также при высоком уровне спонтанных нарушений кариотипа используют дифференциальное окрашивание хромосом и проводят кариотипический анализ на 30-40 микрофотографиях для каждого животного.
Кариотипический анализ
Кариотипический анализ позволяет точно идентифицировать каждую хромосому набора, определить гомологичные хромосомы 44
