Результаты анализа гена В LAD методом ПЦР - ПДРФ

Амплификаты из ядерной ДНК должны представлять собой полосу длиной 132 п.н.

После рестрикции полученных амплификатов на электрофореграмме должна наблюдаться следующая картина:

Животные, гомозиготные по нормальному аллелю гена BLAD, имеют генотип NN (нормальный аллель обозначают как N). Они здоровы и не являются носителями мутации.

Появление дополнительных сайтов рестрикции и, соответственно, появление дополнительных фрагментов ДНК на электрофорезном геле свидетельствует о том, что в результате точковой мутации произошла замена основания А — аденина на основание G — гуанин в гене, ответственном за проявление BLAD-синдрома. Мутантный аллель обозначается как В.

У гетерозиготной особи в геноме присутствуют два аллеля гена BLAD, один — поврежденный мутацией (В), другой — не поврежденный (N). Это генотип NB. Фенотипически такие животные являются здоровыми, но несут в своем генотипе рецессивный мутантный аллель.

Животные с двумя мутантными аллелями (генотип ВВ) являются носителями мутации и неизлечимо больны.

Необходимое оборудование

1. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением.

2. Микроцентрифуга типа «Эппендорф».

3. Термостат.

4. Прибор для горизонтального гель-электрофореза с источником постоянного тока, кювета для формирования агарозного геля, гребенки для формирования лунок в геле, подложки для геля.

5. Трансиллюминатор с фотоаппаратом или видеокамерой.

6. 6 . Морозильник (-20°С).

1. Электрическая плитка.

8 . Бидистиллятор.

1. Весы технические до 500 г.

2. pH-метр или универсальная индикаторная бумага.

11 • Аппарат для перегонки фенола (круглодонная колба с тремя шлифами, суховоздушный холодильник, асбест для изоляции холодильника, электрическая плитка).

1. ДНК — амплификатор (термоциклер).

2. Пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл и 0,5 мл.

1. Вариационные пипетки 0,5-10 мкл, 5-40 ， 40-200 ， 100-

1 0 0 0 мкл.

1. Мерные колбы на 2, 1 0,5 л, мерные стаканы на 1 л, 0,5 л, цилиндры мерные 100 мл, пипетки на 1 5, 10 мл.

2. Перчатки резиновые.

Нормы

Производительность труда по данной методике составит

50 проб в месяц на одного сотрудника лаборатории.

5. Цитогенетический метод выявления аномалий у крупного рогатого скота

Позволяет выявить численные нарушения кариотипа и хромосомные перестройки у аномальных потомков и их родителей.

Для предотвращения распространения вредных аберраций, повреждений хромосом необходим систематический контроль (мониторинг) за состоянием кариотипов у основной воспроизводящей части популяций.

Изучение кариотипа у аномальных животных и их родителей проводят для обнаружения хромосомных и геномных мутаций, структурных изменений хромосом и количественных изменений кариотипа как причины фенотипических аномалий.

5.1. Необходимые материалы

1. Питательные среды для культивирования лейкоцитов (игла, N 199, RPMI 1640 или их смесь).

2. Реактивы.

Реактивы

1. Митогены (фитогемагглютинин, Concanavalin А).

2. 2 . Гепарин.

3. КС1.

4. Метиловый или этиловый спирт.

5. 5 . Ледяная уксусная кислота.

6. 6 . Антибиотики (пеницилин и стрептомицин).

7. Красители азур и эозин (краситель Романовсного).

8. 8 . Краситель Гимза.

9. Краситель акридиновый оранжевый.

5.2. Правила получения и хранения биологического материала для цитогенетического анализа

Биологическим материалом для проведения цитогенетического анализа служат лейкоциты и лимфоциты периферической крови. Общим правилом взятия биологического материала является обязательное соблюдение стерильности при взятии крови.

Взятие и доставка образцов крови

Периферическая венозная кровь в количестве 5-10 мл забирается в стерильный одноразовый шприц и переносится в стерильную пробирку или флакон с 0 , 05 - 0,1 мл стандартного раствора гепарина (5000 ЕИ в 1 мл). У крупного рогатого скота кровь берется стерильной одноразовой системой во флакон из яремной вены.

Перед взятием крови поверхность кожи в месте введения иглы стерилизуют 70%-ным спиртом. Вся процедура взятия крови должна быть проведена с максимальным соблюдением стерильности.

Образцы крови помещают в сумку-холодильник или термос при температуре 2-4°С и направляют в лабораторию в течение 1-2 ч с момента взятия биологического материала.

К образцам прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, родителей, возраста, породы.