- Гепарин. 18. Сахароза.
Правила получения и хранения биологического материала
Ген BLAD-синдрома выделяют из проб крови (3-5 мл), кожи 2 (площадью приблизительно 0,1 см или 0,1-0,3 г) или спермы ( 2 0 мкл).
Образцы крови необходимо консервировать одним из консервантов:
гепарин — 0 , 0 1 мл на пробирку;
цитрат натрия — 1,5 мл на пробирку раствора следующего состава:
цитрат натрия 50 г сахароза 0,5 г дистиллированная вода до 1 0 0 0 мл
Кусочки кожи и сперму не консервируют.
Образцы крови, кожи，спермы транспортируют в охлажденном виде при температуре от 0оС до +4°С в течение одних суток.
Образцы хранятся при температуре -20°С в течение одного месяца.
Приготовление основных растворов
1М Трис-HCl рН=7,6. Растворяют 121,1 г трис-HCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до необходимого значения добавлением концентрированной соляной кислоты. Для достижения pH 7,6 необходимо добавлять постепенно при перемешивании приблизительно 60 мл концентрированной НС1. При этом постоянно измерять значение pH pH-метром или универсальной индикаторной бумагой (pH 0-12). Перед окончательным доведением pH дают раствору остыть до комнатной температуры. Доводят объем раствора до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
0,5М ЭДТА, рН=8,0. Добавляют 186,1 г двухзамещенной соли ЭДТА х 2Н20 к 800 мл дистиллированной воды. Интенсивно размешивают на магнитной мешалке. Доводят постепенно pH до 8 с помощью концентрированного раствора NaOH, не забывая постоянно проверять значение pH. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. Динатриевая соль не растворяется до тех пор, пока pH раствора не будет доведен добавлением NaOH приблизительно до 8 .
5М NaCl. Растворяют 292,2 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
1М MgCl2. Растворяют 203,3 г MgCl2 х 6Н20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. MgCL 2 гигроскопичен.
ЗМ ацетат натрия р№=5,2. Растворяют 408,1 г ацетата натрия х ЗН20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.
1М дитиотрейтол (DTT). Растворяют 3,09 г DTT в 20 мл 0,01М ацетата натрия рН=5,2. Стерилизуют фильтрованием, разливают на порции по 1 мл и хранят при -20°С.
называемый также 10%-ный додецилсульфат натрия (SDS )， лаурилсульфатом натрия. Растворяют 100 г химически чистого SDS в 900 мл дистиллированной воды. Нагревают до температуры 6 8 °С, чтобы ускорить растворение. Доводят pH до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной НС1. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции. Раствор не стерилизуют.
Бромистый этидий, 10 мг/мл. Добавляют 1 г бромистого этидия к 100 мл дистиллированной воды. Размешивают на магнитной мешалке несколько часов, пока краситель не растворится. Завертывают колбу в алюминиевую фольгу или переливают в темную склянку и хранят при температуре 4°С. Бромистый этидий — мутаген (работают в перчатках).
Растворы ферментов протеиназы К и РНКазы А. Растворить сухую панкреатическую протеиназу К в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Концентрация в реакции 0,2-0,5 мг/мл. Температура реакции 37°С. Предварительная обработка фермента не требуется. Хранить при температуре -20°С.
Растворить панкреатическую РНКазу А в концентрации 10 мг/мл в дистиллированной воде или в 10 мМ Трис-Нс1, pH 7,5 и 15 мМ NaCl. Прогрейть 10 мин при температуре 95-100°С для разрушения ДНКазы и медленно охладить до комнатной температуры. Разлить на порции, хранить при -20°С. Концентрация в реакционной смеси 0 , 1 мг/мл.
Выделение ДНК из крови К 3-5 мл крови добавляют по капле, непрерывно помсши вая, 40-60 мл охлажденного 0,1 мМ ЭДТА; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 15-20 мин с охлаждением (тип центрифуги K70D или K23D), осаждая ядра лейкоцитов; удаляют супернатант; осадок, состоящий из ядер лейкоцитов, отмывают рядом следующих друг за другом ресуспендирований и центрифугирований в буфере 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8) до исчезновения примеси гемоглобина; центрифугируют при 3000 мин' 1 15-20 мин с охлаждением; отмытый осадок ядер лейкоцитов подвергается лизису. Для этого к осадку добавляют lxSTE буфер (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8, 100 мМ NaCl), 10% SDS до конечной концентрации 1%, протеиназу К до конечной концентрации 200-500 мкг/мл; лизирование ядер лейкоцитов проводится при комнатной температуре в течение ночи; лизат обрабатывают РНКазой в течение 1 ч при температуре 37°С для разобщения ДНК с РНК, добавляя фермент до конечной концентрации 1 0 0 мкг/мл; проводят экстракцию ядерной ДНК из лизата фенольнохлороформным методом. Для этого к полученному объему лизата добавляют равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола; тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; если органическая и водная фаза хорошо разделились, соберите водный слой (если недостаточно, то центрифугируйте еще раз более продолжительное время или при большей скорости). Промежуточную и нижнюю органическую фазы отбросить; добавляют к собранной водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1); тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; отсасывают пипеткой водную фазу;
