На основе этой реакции разработан нитритный метод. (Ван-Слайка) определения аминокислот по количеству выделяющегося азота. При реакции аминокислот с нингидрином образуется угольцый ангидрид и соответствующий альдегид, количество которых может быть определено.
Имеется ряд специфических реакций на отдельные аминокислоты. Гистидин и тирозин, например, определяют колориметрически в результате реакции с диазотидлярованпойопределениясульфаниловойкаждой изкислотойаминокислот(реакцияих.нужноПаули),раз-но делить. Триптофан определяется колориметрически на основе реакции с парадиметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) и нитритом натрия в кислой среде Метионин дает окрашивание с нитропруссидом в ИЛЬ. но щелочном растворе. Качественные методы определения содержания тирозина, аргиница, фенилаланина, триптофана также относятся к специфическим. В лабораторной практике только искоторые из химических методов количественного определения аминокислот паходят применение, так как остальные сравнительUO трудоемки, мало производительны и для них необходимы дефицитные реактивы. Наиболее доступны химифана, глицина. ческие методы определения лизина, метионина, триптоЛизин определяется на основании окрашивания в реакции с дипитрофторбензолом (ДНФБ). Интенсивжелтыйность окраскицвет эпсилондает (г)возможностьаминогруппыопределитьпри химическойсодерноежаниеколичестволизина. Этимэтой аминокислотыже методом определяютдля организмаи достун-животпых. Триптофан определяется на основании его свойства давать с парадиметиламинобензальдегидом окраску, инаминокислоты.теисивность которойНаиболеепропорциональначасто этот метод концентрациииспользуется в лабораторной практике, поскольку при кислотном гидролизе триитофан разлагается. Определить мегиопин можно по реакции его с питропруссидом натрия. Хроматографический метод определения аминокислот впервые предложен русским ботапиком М. С. Цветом в 1903 г. Метод оспован на принциие адсорбции. В послед-
ние два десятилетия он широко использовался для определения аминокислот.
Особенную популярность получили методы расиредедлительной хроматографии на бумаге и ионообменной хроматографии. Как правило, указанными методами онределяются постоянно встречающиеся аминокислоты в чистых белках, свободные аминокислоты, а также в различных биологических материалах и тканях (продукты растительного и животного происхождения, кровь, моча, молоко, шерсть и др.). Определение аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге основано на распределении их между двумя фазами — неподвижной {целлюлоза бумаги, пропитанная водой) и подвижной (не смешивающийся с водой растворитель). Молекулы аминокислот переносятся подвижной фазой в новое место, причем каждая аминокислота имеет свой коэффициент распространения, в результате чего опи располагаются на листе бумаги на различном расстоянии друг от друга. Схематично весь процесс сводится к выполнению следующих последовательных операции: подготовка ооразца к гидролизу, гидролиз белка или биологического объекта, подготовка гидролизата к анализу и нанесение его телей (хроматографирование), обработка хроматограмм на полоску бумаги, пропускание органических растворираствором нингидрина в ацетоне, элюция аминокислот, со стандартом и расчет содержания аминокислоты в установлениепробе и образце.экстинкцииПодготавливаетсяна фотометреобразеци сравнениек гидролизуее обезжириванием его, удалением углеводов (из высокоуглеводистых материалов), выделением суммарного белка. Чтобы ne допустить разрушения серусодержащих амипокислот (метионина, цистина, цистеина), в процессе гидролиза проводят оксидацию его надмуравьиной кислотоймуравьиной(1 мл кислоты,30%-ной смесьперекисивыдерживаютводорода9в млтечение88%-нойчаса при температуре 15—20°C, а затем охлаждают до 0°). В процессе оксидации цистин и цистеин окисляются до цистеиновой кислоты, а метионин — до метионинсульфона, которые устойчивы к воздействию 6 н. HCI. Наиболее ответственная и сложная операция в провсдении хроматографии — это гидролиз образца. Выбор оптимальных условий гидролиза является решающим
19
для точности определения аминокислот при последующей за этим процессом хроматографии. Малейшее нарушение процесса гидролиза может привести к деструкции значительного количества аминокислот. Особенно большое внимание должно быть уделено сохранению соотношения навески к гидролизующему реагенту. Наиболее мягко гидролиз проходит в 6 н.НС1. В зависимости от температурных условий, давления, продолжительности гидролиза оптимальное соотношение навески к HCl, no данным различных авторов, составляет от 1:40 до 1:2000. Так, при гидролизе в колбах с обратным холодильником на бане при температуре 110—115° в течение 20—24 часов оптимальное соотношение 1:200; при гидролизе в автоклаве под давлением в две атмосферы и температуре 137° в течение 6 часов — 1:400, 1:1000; при гидролизе в запаянных ампулах в термостатах или бане при температуре 110° в течение 24—32 часов — 1:1000, 1:2000. Наиболее часто применяется гидролиз в запаянных ампулах, потому что в этом случае обеспечиваются благоприятные условия разложения белка и незначительные потери аминокислот. до Подготовленныйкомнатнойтемпературы для анализаиосвобождают гидролизат охлаждаютOTгуминов путем фильтрования в воронке Нутчи с использованием водоструйного насоса через двойной бумажный фильтр. Осадок на фильтре отмывается небольшим количеством подкисленного (на 10 мл воды 2—3 капли 6-нормальной НС!) соляной кислотой бидистиллята. Фильтрат освобождают от HCl выпариванием в колбах Вюрца (рис. 1 и 2) под вакуумом или на роторном испарителе при ляютобмываюттемпературенесколькостенки50—55°.миллилитровколбыК упаренномуи повторнобидистиллята,гидролизатувыпаривают.тщательнодобав-Полученный осадок растворяют бидистиллятом и переносят в градуированные пробирки (при объемном методе измерения) или в бюксы с известным весом (при весовом методе измерения). Весовой метод считается более точным. В бюксах гидролизаты сгущают в вакуумэксикатоpe под сухим КОН до нужного веса. Обычно расчеты веса, до которого необходимо сгустить гидролизат, производят путем деления азота (в мкг) в навеске прогидролизованного корма на 2000. В этом случае концентрация азота в гидролизатах различных образцов будет
