постоянная температура (20—25°C). Лучшие растворители: 6 танол-+ уксусная кислота - вода в соотношении 300: “60-140 астворитель хорошо разделяет цистин, лизин ги. стидин, АНИ аланин тирозин фенилалании при 3 4- разовом пропускании; бутанол-уксусная Е в соотношении 4:1:5 (одно пропускание), а затем в соотношении 40:15:5 (3—4-разовое пропускание) для разделения аспарагиновой кислоты, серина, гликокола, глутаминовой кислоты, треонина, метионина и валина; Н-бутиловый спирт-+муравьиная кислота (85%-ная)+ вода в соотношении 75:15:15 применяется для разделения аспарагиновой кислоты, серина, глицина, глутаминовой кислоты при 5-кратном пропускании.
После хроматографирования бумагу сушат в вытяжОHone шкафуПЕКилиgk”в понспециаявном отолущажениниостатковарастворийвсорильном шкафу под теля и проявляют 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Обработанную в нингидриновом растворе бумагу сушат 3—5 минут в вытяжном шкафу для удаления ацетона и помещают в затемнеиный шкаф (сушильный) на 10—12 часов для интенсификации окраски. Сушить хроматограммы можно также в обычном сушильо.ном шкафу при температуре 60°С под током воздуха В результате реакции разделившихся на бумаге аминокислот с нингидрином образуются пятна разной степени окрашивания. Чтобы закрепить окраску пятен аминокислот, их смачивают из пипетки раствором азотнокислой меди (1 мл насыщенного раствора Cu(NOs)2+ +0,02 мл 65%-ной HNO; н 99 мл ацетона). Пятна аминокислот вырезают, помещают в пробирки и заливают 8 мл 75%-ного этилового спирта и оставляют на 2 часа в темноте. Экстинкция элюатов, полученных из окрашенных пятен, определяется на фотометре (ФЭК-М) в кювете на 10 мл при зеленом (если окраска не закреплена азотнокислой медью) или при синем (при закреплении окраски азотнокислой медью) светофильтре. теинуСодержаниерассчитываетсяаминокислпо ф о трмуле:в процентах к сырому про-
_E,A-C-10(1 0 0—K)
Е.О РМ 6,25
где Е; — экстинкция амннокислоты исследуемого об- 7
Ey — экстиикция аминокислоты, стандарт;
А — количество аминокислоты в нанесенном в од-
СQ —— общееколичествону полосуколичествостандарта,гидролизата,гидролизата,г; нанесенногог или намл;одну
полосу на хроматограмме, г или мл;
Р — количество гидролизуемого образца;
K — содержание жира в воздущно-сухом вещест-
- М — содержание азота в воздушно-сухом вещест-
етсяСреднееиз 6содержаниепараллельныхкаждойпоказанийаминокислотыс двух хроматограмм.рассчитываОпределение аминокислот методом ионообменной хроматографии основано на разделении в полистироловых смолах с последующей элюцией, обработкой нингидрином и колориметрированием. Чаще в ионообменной хроматографии применяют катиониты типа Даукс-50, Амберлит JR-120 Зео-Карб и другие. Эти смолы относятся и катнонообменникам. При сульфировании они присое-
и. т
oa pilatesee : o
Е в. pele ae a
о a Ae
to & oa BE: eo
fees. В | о и
ee ie на: a ee cee a: rt
ie* №aeeeиa Е ae ie oa©eee Gg < yee;iedfTdeel oe| ›
в. ®[] . ох
о: ee о
(2 --- ег : es ae :
о м. °° i a. :
ом Я 7
a ee eeneee ae aa:
Е р OO OH
: PTS Mae Nee: Po Sere | ae
Е ie ae Ge i] ie
и 1 : м | ifs
Piles
SIR a ae fa Ry Е и
о ем. я р. в
а aoe ol Gee
о = не ие | |. on is
а ree us 3
р геА Baeey fee a. ee |
ie oa. Se. OY |
о : м> в -
м г ш и
| im | ‘=i ам о м
ar | eo __ af ae se ae
| See) о вый he Bae бе |
Pee | ee | Вере | te oo)
Г июнь ^^ ЗА ВЛЕВО ое В
Рис. 6. Автоматический апалиРис. т. И ПИР затор аминокислот Hd-—-1200E. затор и
диняют нонообменные группы ЗО3Н. В воде смолы силь но набухают, образуя гелеподобную массу. Когда DO: пускается гидролизат изучамого белкового вещества через колонку, заполненную понпообменной смолой, аминокислоты распределяются в соответствии с их Rj между водной фазой и фазой теля. Элювнруют аминокислоты буферными растворами при определелных рН. и Указанный метод, разработанный Муром и Стейном, позволил сконструировать для определения аминокислот специальные автоматические аминокислотные анализаторы типа KJIA-3 японской фирмы «Хитачи»: «Унихром» — американской; Hd=1200 Е чехословацкой и На автоматическом апализаторе пробу аминокислот вводят в верхнюю часть колонки анализатора вручную или с помощью автоматических заборников проб и элтои-
25
