Подготовка комплемента

Перед постановкой реакции гемолиза размораживают необходимый объем комплемента, поместив стеклянный пузырек с ним в теплую воду (28-30°С).

Комплемент, оставшийся после постановки реакции, необходимо уничтожить, так как он резко теряет активность и приходит в негодность при повторном замораживании.

Приготовление суспензии эритроцитов

Для постановки серологических реакций необходимо приготовить 2,5%-ную суспензию эритроцитов из образцов крови исследуемых животных. Техника приготовления суспензий состоит из следующих операций.

1. Трехкратное отмывание эритроцитов.

Отмывание эритроцитов производят физиологическим раствором (0,85%-ный раствор хлористого натрия при pH = 6 ,7-7,0) для удаления белков: на чистые центрифужные пробирки наносят номера образцов крови; в каждую пробирку вносят 1,5-2 мл хорошо перемешанной консервированной крови и 7-8 мл физиологического раствора; перемешивают содержимое пробирки путем осторожного переворачивания и центрифугируют при 2000-2500 мин' 1 в течение 5-7 мин; водоструйным насосом удаляют надосадочную жидкость и верхний слой эритроцитов с белой пленкой (оставшиеся белки); к осадку эритроцитов вновь добавляют физиологический раствор и проводят повторное отмывание не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет светлой и прозрачной.

1. Приготовление стандартной суспензии. В пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора. Вносят 2,5 мл отмытых эритроцитов любого образца, предварительно перемешав их легким встряхиванием. Содержимое пробирки перемешивают, переворачивая 5-6 раз.

Полученная 2,5%-ная суспензия эритроцитов является эталоном (стандартом) для приготовления рабочих суспензий.

1. Приготовление 2,5%-ной рабочей суспензии эритроцитов. На чистые пробирки наносят номера отмытых образцов крови. В каждую пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора и вносят каплями отмытые эритроциты соответствующего образца.

Готовят 2,5%-ную суспензию путем сравнения со стандартом по интенсивности окраски.

Суспензию можно хранить пять-шесть дней при температуре 2- 4°С.

Подготовка бланка серологического теста

Серологический тест — это основной рабочий документ при тестировании животных по группам крови, в котором фиксируются результаты серологических реакций. Бланк теста заполняют перед постановкой реакции (кроме результатов читки). В шапке документа указывается:

хозяйство, из которого поступили образцы крови;

порядковый номер теста;

дата постановки реакции;

время начала отдельных операций при постановке реакции.

В левой полосе записывают номера образцов крови, индивидуальные номера и клички животных, у которых определяют тип крови.

В верхней полосе слева направо вписывают наименования реагентов (с указанием их титра) строго по-системно, согласно алфавиту (А, В, С, F, J, L, М, S, Z, R-S').

Правила постановки реакции гемолиза для определения эритроцитарных антигенов

Выявление антигенов эритроцитов крупного рогатого скота производят путем постановки реакции гемолиза.

Принцип реакции заключается в связывании антитела с антигеном в присутствии комплемента, в результате чего происходит гемолиз эритроцитов и выход гемоглобина в жидкую фазу с окрашиванием ее в красноватый цвет.

Степень гемолиза отмечают в протоколе (серологическом тесте) при первом и втором чтениях реакции.

Техника постановки реакции гемолиза

Реакция гемолиза проводится в блоках или пластинах из прозрачного оргстекла с круглыми глубокими ячейками (гнездами), предназначенными для внесения и смешивания компонентов, участвующих в реакции.

Подписывают блоки: по горизонтали сверху пишут наименование реагентов или их порядковый номер, согласно серологическому тесту, по вертикали с левой стороны — номера образцов крови исследуемых животных.

В каждый ряд лунок вносят по вертикали по две капли определенной сыворотки-реагента, по горизонтальным рядам — по одной капле 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Последний вертикальный ряд является контрольным, в каждую лунку которого вносят по две капли физиологического раствора вместо сыворотки. Блоки со смесью энергично встряхивают до полного растворения осадка на дне лунки. В бланке гемолитического теста отмечают время начала постановки реакции. Инкубируют при комнатной температуре 20 мин. В каждую лунку вносят по одной капле комплемента. Блоки тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре 26-28°С на 30 мин. Проводят повторное встряхивание и инкубацию в термостате 1,5-2 ч. Проводят первое чтение реакции с записью результатов в серологический тест. После тщательного перемешивания инкубируют еще 1-2 ч в термостате. Проводят вторую читку реакции с записью ее результатов в тот же серологический тест.

Оценка реакции гемолиза

Оценка реакции проводится по пятибальной системе:

0 — реакция отрицательная. Полное отсутствие гемолиза. Эритроциты оседают на дно в виде крупной красной точки, с резко очерченными краями, надосадочная жидкость прозрачная, соломенно-желтого цвета.

4 балла — реакция положительная. Полный гемолиз всех эритроцитов. Совершенно нет осадка, надосадочная жидкость равномерно окрашена в розово-красный цвет.

3 балла — реакция положительная. На дне небольшое количество эритроцитов (1/3 от контроля) в виде просвечивающейся пленки. Надосадочная жидкость окрашена в слабо-розовый цвет. Вокруг осевших эритроцитов хорошо виден ореол окрашенной жидкости.

2 балла — реакция сомнительная. На дне лунки половина осевших эритроцитов. Жидкость вокруг осадка в виде круга окрашена в розово-красный цвет. Остальная надосадочная жидкость прозрачна.