Готовят 2,5%-ную суспензию путем сравнения со стандартом по интенсивности окраски.
Суспензию можно хранить пять-шесть дней при температуре 2- 4°С.
Подготовка бланка серологического теста
Серологический тест — это основной рабочий документ при тестировании животных по группам крови, в котором фиксируются результаты серологических реакций. Бланк теста заполняют перед постановкой реакции (кроме результатов читки). В шапке документа указывается:
хозяйство, из которого поступили образцы крови;
порядковый номер теста;
дата постановки реакции;
время начала отдельных операций при постановке реакции.
В левой полосе записывают номера образцов крови, индивидуальные номера и клички животных, у которых определяют тип крови.
В верхней полосе слева направо вписывают наименования реагентов (с указанием их титра) строго по-системно, согласно алфавиту (А, В, С, F, J, L, М, S, Z, R-S').
Правила постановки реакции гемолиза для определения эритроцитарных антигенов
Выявление антигенов эритроцитов крупного рогатого скота производят путем постановки реакции гемолиза.
Принцип реакции заключается в связывании антитела с антигеном в присутствии комплемента, в результате чего происходит гемолиз эритроцитов и выход гемоглобина в жидкую фазу с окрашиванием ее в красноватый цвет.
Степень гемолиза отмечают в протоколе (серологическом тесте) при первом и втором чтениях реакции.
Техника постановки реакции гемолиза
Реакция гемолиза проводится в блоках или пластинах из прозрачного оргстекла с круглыми глубокими ячейками (гнездами), предназначенными для внесения и смешивания компонентов, участвующих в реакции.
Подписывают блоки: по горизонтали сверху пишут наименование реагентов или их порядковый номер, согласно серологическому тесту, по вертикали с левой стороны — номера образцов крови исследуемых животных.
В каждый ряд лунок вносят по вертикали по две капли определенной сыворотки-реагента, по горизонтальным рядам — по одной капле 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Последний вертикальный ряд является контрольным, в каждую лунку которого вносят по две капли физиологического раствора вместо сыворотки. Блоки со смесью энергично встряхивают до полного растворения осадка на дне лунки. В бланке гемолитического теста отмечают время начала постановки реакции. Инкубируют при комнатной температуре 20 мин. В каждую лунку вносят по одной капле комплемента. Блоки тщательно встряхивают и помещают в термостат при температуре 26-28°С на 30 мин. Проводят повторное встряхивание и инкубацию в термостате 1,5-2 ч. Проводят первое чтение реакции с записью результатов в серологический тест. После тщательного перемешивания инкубируют еще 1-2 ч в термостате. Проводят вторую читку реакции с записью ее результатов в тот же серологический тест.
Оценка реакции гемолиза
Оценка реакции проводится по пятибальной системе:
0 — реакция отрицательная. Полное отсутствие гемолиза. Эритроциты оседают на дно в виде крупной красной точки, с резко очерченными краями, надосадочная жидкость прозрачная, соломенно-желтого цвета.
4 балла — реакция положительная. Полный гемолиз всех эритроцитов. Совершенно нет осадка, надосадочная жидкость равномерно окрашена в розово-красный цвет.
3 балла — реакция положительная. На дне небольшое количество эритроцитов (1/3 от контроля) в виде просвечивающейся пленки. Надосадочная жидкость окрашена в слабо-розовый цвет. Вокруг осевших эритроцитов хорошо виден ореол окрашенной жидкости.
2 балла — реакция сомнительная. На дне лунки половина осевших эритроцитов. Жидкость вокруг осадка в виде круга окрашена в розово-красный цвет. Остальная надосадочная жидкость прозрачна.
1 балл — реакция сомнительная. Большинство эритроцитов осело на дно лунки (примерно 3/4 величины точки в контроле). Надосадочная жидкость слабо окрашена в соломенно-розовый прозрачный цвет.
Сомнительные реакции подлежат перепроверке.
1.4. Определение генотипов животных по группам крови
Генотип каждого животного складывается из наследственных задатков родителей. В зависимости от степени изученности и сложности систем антигенов, количества аллельных форм и их сочетаемости в стадах возможно выявлять разное число генотипических классов крупного рогатого скота.
При определении генотипов по группам крови в каждой системе выявляют оба аллеля, унаследованные от родителей. Обозначают генотипы в виде дроби: первая группа факторов унаследована от отца, вторая — от матери (например, BIOiy2D'A'Of).
Системы групп крови по генетической структуре подразделяются на простые, включающие не более двух антигенов, и сложные, состоящие из трех и более антигенов.
В однофакторных системах (I, L, М, Z, N', Т ) различают два аллеля: один обуславливает присутствие, другой — отсутствие соответствующего антигена.
В двухфакторных системах (F, R’-S’）каждый антиген представляет группу крови.
Для многофакторных систем (А, В, С, S) характерно широкое разнообразие групп крови. Большинство их состоит из нескольких факторов, наследуемых как единое целое.
При регулярном исследовании групп крови, когда генотипы быков и коров уже известны, определение генотипов потомков и проведение контроля достоверности их происхождения значительно упрощается. Уточнения могут потребоваться лишь при получении новых реагентов, которыми отцы и матери ранее не исследовались. Выявленные генотипы заносятся в компьютер.
На основании расписанных генотипов составляется ведомость — «тест», которая является выходным документом № 1 при генетической экспертизе племенной продукции.
