Реактивы

1 . Глюкоза кристаллическая гидратная ГОСТ 975-75 2. Хлористый натрий по 0,9 г в таблетках ГОСТ 4233-77 3. Лимоннокислый натрий трехзамещенГОСТ 22280-76 ный 4. Риванол (этакридин лактат) ГФ, X СТ27 5. Альбуцид (сульфацил натрия) ГФ, X СТ641 6 . Левомицетин ГФ, X СТ371 7. Спирт ректификат 8 . Кислота серная техническая удельным 1,82-1,84 весом 9. Двуххромовокислый калий (К 2 СЮ 7) ГОСТ 4220-75 10. Сода кальцинированная ГОСТ 83-79

1.2. Правила получения и хранения образцов крови

Пробы крови для генетической экспертизы у крупного рогатого скота берут из яремной вены по общепринятой методике специалисты ветеринарной службы хозяйства в присутствии зоотехникаселекционера.

Получение образцов крови

Образцы крови берут в стерильные пробирки.

Перед взятием крови пробирки номеруют и вносят в них по 3-6 мл антикоагулянта и расставляют в штатив;

осторожно по стенке пробирки приливают кровь в объеме 1 - 2 мл (соотношение антикоагулянта и крови 3:1);

пробирку закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для перемешивания содержимого;

в ведомость взятия крови сразу записывают индивидуальный номер животного, у которого взята кровь.

Доставка и хранение образцов крови

Образцы крови помещают в сумку-холодильник или термос при температуре 2-4°С и направляют в лабораторию в течение 1-2 суток со дня взятия крови.

К образцам крови прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, возраста, породы, родителей. Образцы крови хранят в холодильнике при температуре 2-4°С не более 1-2 недель.

1.3. Метод и правила определения антигенного спектра эритроцитов

Антигенный состав крови крупного рогатого скота определяют по результатам постановки серологических реакций с помощью моноспецифических сывороток реагентов.

Сущность реакции состоит в том, что антитела, содержащиеся в сыворотках-реагентах, соединяются с гомологичными антигенами эритроцитов крови исследуемого животного. Соединение антигена с антителом в присутствии комплемента (нормальной кроличьей сыворотки) вызывает разрушение оболочек эритроцитов (гемолиз) и освобождение гемоглобина, который окрашивает жидкость в красноватый («лаковый»). При отсутствии антигена реакция не происходит, эритроциты остаются неповрежденными и оседают на дно.

Подготовка материалов для постановки реакции гемолиза

Перед проведением иммунологической реакции необходимо подготовить к работе реагенты, суспензии эритроцитов, серологические тесты, штативы с пробирками и т.д.

Подготовка реагентов

1. Для размораживания реагенты переносят в лабораторное помещение с комнатной температурой. Для ускорения процесса флаконы можно поставить в теплую воду с температурой не выше 36 — 37°С.

2. Готовят рабочие титры в соответствии с маркировкой на флаконах. Сыворотки разбавляют физиологическим раствором на одну-две ступени ниже их предельного тира, указанного на флаконе. Например, если реагент имеет титр 1:32, то для работы его надо разбавить не более, чем в 16 раз.

Реагенты с рабочим титром должны быть использованы в течение одного дня. Неиспользованные реагенты замораживают, затем используют в течение ближайших двух-трех дней.

Подготовка комплемента

Перед постановкой реакции гемолиза размораживают необходимый объем комплемента, поместив стеклянный пузырек с ним в теплую воду (28-30°С).

Комплемент, оставшийся после постановки реакции, необходимо уничтожить, так как он резко теряет активность и приходит в негодность при повторном замораживании.

Приготовление суспензии эритроцитов

Для постановки серологических реакций необходимо приготовить 2,5%-ную суспензию эритроцитов из образцов крови исследуемых животных. Техника приготовления суспензий состоит из следующих операций.

1. Трехкратное отмывание эритроцитов.

Отмывание эритроцитов производят физиологическим раствором (0,85%-ный раствор хлористого натрия при pH = 6 ,7-7,0) для удаления белков: на чистые центрифужные пробирки наносят номера образцов крови; в каждую пробирку вносят 1,5-2 мл хорошо перемешанной консервированной крови и 7-8 мл физиологического раствора; перемешивают содержимое пробирки путем осторожного переворачивания и центрифугируют при 2000-2500 мин' 1 в течение 5-7 мин; водоструйным насосом удаляют надосадочную жидкость и верхний слой эритроцитов с белой пленкой (оставшиеся белки); к осадку эритроцитов вновь добавляют физиологический раствор и проводят повторное отмывание не менее 3 раз, пока надосадочная жидкость не станет светлой и прозрачной.

1. Приготовление стандартной суспензии. В пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора. Вносят 2,5 мл отмытых эритроцитов любого образца, предварительно перемешав их легким встряхиванием. Содержимое пробирки перемешивают, переворачивая 5-6 раз.

Полученная 2,5%-ная суспензия эритроцитов является эталоном (стандартом) для приготовления рабочих суспензий.

1. Приготовление 2,5%-ной рабочей суспензии эритроцитов. На чистые пробирки наносят номера отмытых образцов крови. В каждую пробирку наливают 9,75 мл физиологического раствора и вносят каплями отмытые эритроциты соответствующего образца.