2.1. Необходимые материалы
реактивы; оборудование.
Реактивы
-
Акриламид.
-
Аммоний надсернокислый (персульфат аммония).
-
Бром-феноловый синий.
-
Глицин.
-
Кумасси R-250.
-
6 . Метилен-бис-акриламид.
-
Сахароза.
-
8 . Соляная кислота.
-
Тетраметиэтилендиамин (ТЕМЭД).
-
Трис-оксиметил-аминометан (трис).
-
Уксусная кислота.
-
Этиловый спирт.
2.2. Правила получения и хранения образцов крови
Пробы крови отбирают также, как и для иммуногенетического анализа. Далее образцы плазмы (сыворотки) и эритроцитов отбирают в мелкие полиэтилленовые пробирки или планшеты и хранят в морозильной камере бытового холодильника в течение месяца. Для более длительного хранения образцов их необходимо поместить в морозильную камеру с температурой -17°С.
Для электрофоретического разделения образцы сыворотки (плазмы) крови необходимо оттитровать 40%-ной сахарозой с индикатором в соотношении 1 : 2 (сыворотка : сахароза).
2.3. Методы и правила определения полиморфных систем белков крови
Для проведения электрофореза необходимые растворы готовят на дистиллированной воде заранее. Растворы всех буферов, сахарозы и персульфата аммония хранят в холодильнике, остальные растворы можно хранить при комнатной температуре.
Растворы
| 1 . 2 0 %-ный акриламид с 8 %-ной сшивкой: |
|---|
| акриламид 96 г |
| метилен-бис-акриламид 4 г |
| вода до 500 мл |
| 2. Гелевый буфер: трис-НС1, pH 7,2 |
| трис 6 г |
| 1NHC1 МО мл |
| вода до 90 мл |
| проверить pH, при необходимости довести |
| 1 NHC1 |
| вода до 1 0 0 мл |
| Г елевый буфер для постальбумина: |
| а) трис 8,67 г |
| лимонная кислота 1,5 г |
| вода до 1 0 0 мл |
| б) смешать 1 объем электродного буфера (см. далее) и 5,25 |
| объема раствора а). |
| 3. Электродный буфер: трис-глицин, pH 8,3 |
| трис 6 г |
| глицин 28,8 г |
| вода 1 0 0 0 мл |
| Перед употреблением разводят 1:10. |
| Электродный буфер для постальбумина: |
| лития гидроокись 2 1 г |
| борная кислота 118 г |
| глицин 28,8 г |
| вода 1 0 0 0 мл |
| Перед употреблением разводят 1:10. |
| 4. Раствор аммония надсернокислого: |
| аммоний надсернокислый (персульфат 1 , 6 г |
| аммония) |
| вода до 1 0 0 мл |
| 5. 40%-ная сахароза с индикатором: |
| сахароза 40 г |
| бром-феноловый синий 0 , 1 г |
| вода 60 мл |
6 . 7%-ная уксусная кислота:
уксусная кислота 70 мл вода до 1 0 0 0 мл 7. Раствор красителя кумасси R 250* 1 г 7%-ная уксусная кислота 1 0 0 мл
Перед употреблением этот раствор разбавляют 7%-ной уксусной кислотой 1 : 1 0 0 .
8 . Смесь для отмывки:
этиловый спирт, вода, уксусная кислота в соотношении 10:10:1 или 5:5:1. Смесь для отмывки можно заменить 7%-ной уксусной кислотой.
Методика постановки электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
Приготовление ПААГа
Необходимую концентрацию геля готовят так, как указано в табл. 1. Необходимо строго соблюдать последовательность и количество добавления компонентов.
Таблица 1
Схема приготовления ПААГа различной концентрации
| № | Компоненты | Концентрация геля, | % | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| п/п | 5 | 7,5 | 8 | 1 1 0 | 1 1 | 1 12,5 | |
| 1 . | 2 0 %-ный акрила мид, мл | 2 0 | 30 | 32 | 40 | 44 | 50 |
| 2 . | Г елевый буфер, мл | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
| 3. | ТЕМЭД, мкл | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 | 75 |
| 4. | Вода, мл | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 | до 75 |
| 5. | Персульфат NH4, мл | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
Указанные соотношения компонентов рассчитаны на общий объем геля 80 мл. Если для работы необходимо большее или меньшее количество геля, то соотношение компонентов следует пересчитать на нужный конечный объем.
- Кумасси R 250 можно заменить амидочерным 10 Б.
