Техника проведения электрофореза

1. Приготовить камеры для заливки геля. Способ сборки камер указан в инструкциях предприятий-изготовителей.

2. Приготовить 10%-ный гель (см. табл. 1) непосредственно перед заливкой камер.

3. Гель заливают в камеры с помощью стеклянного стаканчика с носиком. Во избежание образования воздушных пузырьков эту процедуру проводят следующим образом: камеру слегка наклоняют (от себя), кончик стакана прислоняют к стеклянной пластине камеры и медленно заполняют камеру гелем примерно на 3/4 объема. Затем на гель наслаивают дистиллированную воду. Г ель оставляют для полимеризации в течение 20-40 мин. при комнатной температуре. Заполимеризовавшийся полиакриламид слегка опалесцирует. После полимеризации воду слить.

4. Приготовить 5%-ный гель (см. табл. 1) и залить камеры до верха. Вставить гребенки.

5. Гель оставляют для полимеризации. При медленной полимеризации геля в зимнее время используют термостат.

6 . После успешной полимеризации нижнюю часть камеры разгерметизируют для свободного контакта геля с анодным буфером.

1. Камеры с гелем вставляют в поддоны (при необходимости камеры специально закрепляют) и заливают охлажденные электродные буферы таким образом, чтобы конец гелевой пластинки с гребенками находился в катодном буфере, а противоположный конец — в анодном.

8 . Вынимают гребенки.

1. В ячейки автоматической пипеткой наносят по 5-10 мкл исследуемых образцов, оттитрованных 40%-ной сахарозой с индикатором 1 :2 .

2. Подключают источник питания.

3. Проводят электрофорез в два этапа:

1) при напряжении 100 В — 20 мин,

2) при напряжении 230-250 В в течение 1,5-2 ч.

1. Отключают источник питания.

2. Электродные буферы сливают в емкость и ставят в холодильник. Этот раствор используют в качестве анодного буфера в следующем электрофорезе.

1. Камеру разбирают до гелевых пластинок.

2. При необходимости удаляют лишние участки геля (ячейки и т.п.)

3. Отмечают начало геля, отрезая уголок гелевой пластинки со стороны начала нанесения проб. Когда гель находится вне камеры, легко перепутать начало геля, поэтому возможен другой способ. В последнюю ячейку не наносить образец — в этом случае пустая дорожка на геле будет маркировать конец нанесения проб.

4. Г елевую пластинку переносят в кювету с раствором красителя.

5. Г елевые пластинки помещают в раствор Кумасси на ночь для окрашивания.

6. На следующее утро краску сливают.

7. Г елевые пластинки промывают дистиллированной водой и заливают смесью для отмывки.

8. Смесь для отмывки меняют несколько раз.

9. Идентифицирование генотипов (чтение фореграмм) проводят на хорошо отмытых от фона пластинках геля над лампой искусственного освещения, закрытой матовым фильтром.

10. Результаты вносят в рабочий журнал и выходные документы. Для избежания ошибок или выяснения их причин необходимо рабочий журнал вести с особой тщательностью, отражая в записях постановки методики не только все непредвиденные изменения, но и реальную информацию о режиме проведения электрофореза (напряжение, время), концентрации гелей, pH буферов, титры и количества нанесения образцов и другое, а также в рабочем журнале должен быть отражен календарь приготовления растворов и фирмы-изготовители реактивов.

2.4. Определение генотипов животных по полиморфным белкам

Трансферрин у крупного рогатого скота представлен четырьмя аллелями. На гелевой пластинке (фореграмме) аллели расположены по мере снижения электрофоретической подвижности в следующем порядке: Tf A, Tf Db Tf D2, Tf E (у аллеля Tf А максимальная скорость миграции). Г омозиготы имеют по три полосы, гетерозиготы представляют собой совмещенную картину гомозиготных составляющих (рис. 1 ).

________AD? AA D 1 D 1 ADi D 1 D 7 AE D?E ________

Puc. 1. Спектр генотипов трансферрина у крупного рогатого скота

аллелями: Ptf А Посттрансферрин у крупного рогатого скота представлен двумя 一 быстромигрирующий, Ptf В 一 медленномигрирующий. Г омозиготы (рис. 2) имеют по две полосы, гетерозиготы — три (одна из полос разных гомозигот совпадает по подвижности).

AA ВВ АВ ВВ АВ АВ AA ВВ

Рис. 2. Спектр генотипов посттрансферрина крупного рогатого скота

Постальбумин у крупного рогатого скота представлен двумя аллелями: Pta А — быстромигрирующий, Pta В — медленномигрирующий. Гомозиготы (рис. 3) имеют по одной полосе, гетерозиготы — две.

АА ВВ АВ ВВ АВ АВ АА ВВ

Рис. 3. Спектр генотипов постальбумина крупного рогатого скота

2.5. Необходимое оборудование

1. Автоматические пипетки.

2. Весы на 0,5-1 кг.

3. Весы торсионные на 500 мг.

4. Вытяжной шкаф.