взятие проб биологического материала для тестирования (кровь, ткань или сперма);

выделение и оценка качества ДНК; проведение амплификации (метод ПЦР — полимеразная цепная реакция) фрагмента гена BLAD и оценка качества амплификата; обработка полученного продукта специфическими ферментами (метод ПДРФ — полиморфизм длин рестриктных фрагментов); оценка результатов реакции.

Реактивы

1. Трис-(оксиметил)-аминометан (ЫН2 С(СН2 ОН)з).

2. 2 . Этилендиамин-М，!^，]^，! ^ — тетрауксусной кислоты динатрие-

3. вая соль, 2 — водная (Трилон Б, ЭДТА; C 10HMN 2Na2 O 8 .2 H 2 O).

4. Натрий хлористый (NaCl).

5. Магний хлористый шестиводный (MgCl2 *6 H2 0 ).

6. Додецилсульфат натрия (додециловый эфир серной кислоты

натриевая соль, натрия лаурилсульфат SDS; CH 3(CH2)i iOS0 3Na).

• 6 . Бромистый этидий (ethidium bromide или homidium bromide).

• Концентрированная соляная кислота.

• 8 . Гидроокись натрия (NaOH).

9. Фенол (СбН5ОН).

1. Ацетат натрия CH 3COONa.

2. Борная кислота (НВОз).

3. Ферменты:протеиназа К, РНКаза А.

4. Набор для амплификации:

   • a) реакционный 1 Охбуфер;

   • b) фермент Tag-полимераза;

5. c) смесь, состоящая из четырех дезоксирибонуклеотидов

6. (A T G C)，или каждый из нуклеотидов может быть представлен в наборе по отдельности;

7. d) минеральное масло (можно заменить вазелиновым).

8. Все реактивы можно приобрести отдельно, не в наборе.

9. Праймеры или затравки для синтеза нужного фрагмента ДН. 15. Рестриктазы TagI, Haelll с соответствующем буфером. Хорошая активность ферментов наблюдается в присутствии бычьего сывороточного альбумина (BSA) в концентрации 0,1 мг/мл.

10. Цитрат натрия.

1. Гепарин. 18. Сахароза.

Правила получения и хранения биологического материала

Ген BLAD-синдрома выделяют из проб крови (3-5 мл), кожи 2 (площадью приблизительно 0,1 см или 0,1-0,3 г) или спермы ( 2 0 мкл).

Образцы крови необходимо консервировать одним из консервантов:

гепарин — 0 , 0 1 мл на пробирку;

цитрат натрия — 1,5 мл на пробирку раствора следующего состава:

цитрат натрия 50 г сахароза 0,5 г дистиллированная вода до 1 0 0 0 мл

Кусочки кожи и сперму не консервируют.

Образцы крови, кожи，спермы транспортируют в охлажденном виде при температуре от 0оС до +4°С в течение одних суток.

Образцы хранятся при температуре -20°С в течение одного месяца.

Приготовление основных растворов

1М Трис-HCl рН=7,6. Растворяют 121,1 г трис-HCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до необходимого значения добавлением концентрированной соляной кислоты. Для достижения pH 7,6 необходимо добавлять постепенно при перемешивании приблизительно 60 мл концентрированной НС1. При этом постоянно измерять значение pH pH-метром или универсальной индикаторной бумагой (pH 0-12). Перед окончательным доведением pH дают раствору остыть до комнатной температуры. Доводят объем раствора до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.

0,5М ЭДТА, рН=8,0. Добавляют 186,1 г двухзамещенной соли ЭДТА х 2Н20 к 800 мл дистиллированной воды. Интенсивно размешивают на магнитной мешалке. Доводят постепенно pH до 8 с помощью концентрированного раствора NaOH, не забывая постоянно проверять значение pH. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. Динатриевая соль не растворяется до тех пор, пока pH раствора не будет доведен добавлением NaOH приблизительно до 8 .

5М NaCl. Растворяют 292,2 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.

1М MgCl2. Растворяют 203,3 г MgCl2 х 6Н20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве. MgCL 2 гигроскопичен.

ЗМ ацетат натрия р№=5,2. Растворяют 408,1 г ацетата натрия х ЗН20 в 800 мл дистиллированной воды. Доводят pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции и стерилизуют в автоклаве.

1М дитиотрейтол (DTT). Растворяют 3,09 г DTT в 20 мл 0,01М ацетата натрия рН=5,2. Стерилизуют фильтрованием, разливают на порции по 1 мл и хранят при -20°С.

называемый также 10%-ный додецилсульфат натрия (SDS )， лаурилсульфатом натрия. Растворяют 100 г химически чистого SDS в 900 мл дистиллированной воды. Нагревают до температуры 6 8 °С, чтобы ускорить растворение. Доводят pH до 7,2 добавлением нескольких капель концентрированной НС1. Доводят объем до 1 л. Разливают на порции. Раствор не стерилизуют.

Бромистый этидий, 10 мг/мл. Добавляют 1 г бромистого этидия к 100 мл дистиллированной воды. Размешивают на магнитной мешалке несколько часов, пока краситель не растворится. Завертывают колбу в алюминиевую фольгу или переливают в темную склянку и хранят при температуре 4°С. Бромистый этидий — мутаген (работают в перчатках).

Растворы ферментов протеиназы К и РНКазы А. Растворить сухую панкреатическую протеиназу К в дистиллированной воде в концентрации 20 мг/мл. Концентрация в реакции 0,2-0,5 мг/мл. Температура реакции 37°С. Предварительная обработка фермента не требуется. Хранить при температуре -20°С.

Растворить панкреатическую РНКазу А в концентрации 10 мг/мл в дистиллированной воде или в 10 мМ Трис-Нс1, pH 7,5 и 15 мМ NaCl. Прогрейть 10 мин при температуре 95-100°С для разрушения ДНКазы и медленно охладить до комнатной температуры. Разлить на порции, хранить при -20°С. Концентрация в реакционной смеси 0 , 1 мг/мл.