Выделение ДНК из крови К 3-5 мл крови добавляют по капле, непрерывно помсши вая, 40-60 мл охлажденного 0,1 мМ ЭДТА; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 15-20 мин с охлаждением (тип центрифуги K70D или K23D), осаждая ядра лейкоцитов; удаляют супернатант; осадок, состоящий из ядер лейкоцитов, отмывают рядом следующих друг за другом ресуспендирований и центрифугирований в буфере 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8) до исчезновения примеси гемоглобина; центрифугируют при 3000 мин' 1 15-20 мин с охлаждением; отмытый осадок ядер лейкоцитов подвергается лизису. Для этого к осадку добавляют lxSTE буфер (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8, 100 мМ NaCl), 10% SDS до конечной концентрации 1%, протеиназу К до конечной концентрации 200-500 мкг/мл; лизирование ядер лейкоцитов проводится при комнатной температуре в течение ночи; лизат обрабатывают РНКазой в течение 1 ч при температуре 37°С для разобщения ДНК с РНК, добавляя фермент до конечной концентрации 1 0 0 мкг/мл; проводят экстракцию ядерной ДНК из лизата фенольнохлороформным методом. Для этого к полученному объему лизата добавляют равный объем свежеприготовленного насыщенного буфером фенола; тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; если органическая и водная фаза хорошо разделились, соберите водный слой (если недостаточно, то центрифугируйте еще раз более продолжительное время или при большей скорости). Промежуточную и нижнюю органическую фазы отбросить; добавляют к собранной водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1); тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; отсасывают пипеткой водную фазу;

добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1); тщательно размешивают, пока не образуется эмульсия; центрифугируют при 3000 мин' 1 в течение 10 мин; отсасывают пипеткой водную фазу; осаждают ДНК этанолом, добавив два объема охлажденного 95%-ного этанола к объему полученного раствора ДНК; перемешивают переворачиванием; если ДНК выделилась сразу в виде “медузы”，то ее переносят в 70%-ный спирт с помощью пипетки с расширенным носиком; переносят выделенную ДНК в чистую микроцентрифужную пробирку;

высушивают ДНК на воздухе, стараясь не пересушить; высушенную ДНК разбавляют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде. Объем буфера или дистиллированной воды выбирают в зависимости от количества ДНК.

Выделение ДНК из ткани

0 , 1 г ткани измельчают ножницами, перекладывают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют два объема буфера 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5-8);

в пробирку добавляют 10% SDS (додецилсульфат натрия) до 1%-ной концентрации, протеиназу К (20 мг/мл) до концентрации 200 мкг/мл. Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 2 ч. Можно проводить лизис при температуре 37°С в течение ночи;

добавляют к лизату РНКазу (10 мг/мл), свободную от ДНКаз, до концентрации 100 мкг/мл и инкубируют лизат 1 ч при температуре 37°С. Центрифугируют при 3000 мин' 1 10 мин;

к супернатанту добавляют равный объем фенола (pH 8 ), перемешивают, центрифугируют при 6000 мин' 1 1 0 мин;

добавляют к водной фазе равный объем экстракт-буфера (смесь фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25:24:1), центрифугируют в том же режиме. Собирают водную фазу; добавляют равный объем хлороформа (смесь хлороформа с изоамиловым спиртом 24:1), центрифугируют, отбирают водную фазу. Эту стадию повторяют до исчезновения белой интерфазы;

ДНК из водной фазы осаждают двойным объемом 95%ного этанола, дважды промывают 70%-ным этанолом, подсушивают на воздухе и растворяют в таком объеме воды, чтобы концентрация ДНК составила примерно 0,5 мкг/мл.

Выделение ДНК из спермы

_ Небольшое количество спермы объемом не более 20 мкл промывают буфером (100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (pH 8 ) для освобождения от семенной жидкости;

осаждают центрифугированием при 1 0 0 0 0 мин" 1 на микроцентрифуге в течении 5 мин;

лизис препарата проводят в лизис-буфере объемом 700 мкл (состав буфера ЮмМ DTT, 1% SDS, 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, pH 8 с добавлением протеиназы К до конечной концентрации 1 мг/мл) при температуре 55-60°С в течение ночи. Причем в течение первого часа инкубации препарат тщательно перемешивают встряхиванием каждые 5 мин;

проводят экстракцию водной фазы поочередно: равным объемом фенола, смесью равных частей фенола и хлороформа с изоамиловым спиртом (25:24:1), смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), дважды эфиром;

для осаждения ДНК к водной фазе добавляют 0,7 объема изопропанол;

• центрифугируют при 1 2 0 0 0 мин" 1 в течение 1 0 мин;

• осадок растворяют в 1 0 0 - 2 0 0 мкл воды;

• добавляют ЗМ ацетат натрия до концентрации 0,ЗМ;

• _ осаждают ДНК 2,5 объемами 95%-ного этанола;

• осадок промывают 70%-ным этанолом;

• переосаждают центрифугированием;

• растворяют в воде.

Примечания. 1. Для лизирования ядер лейкоцитов, полученных из крови, и разрушения белков, связанных с ДНК, достаточно использовать 10% SDS. Для качественного выделения ДНК из кожи необходимо использовать оба фермента 一 протеиназу К и РНКазу. Объем лизата выбирается в зависимости от количества осадка с ядрами лейкоцитов (в пределах 0,75-2 мл).

1. Если при экстракции ядерной ДНК из лизата белая интерфаза достаточно большая, сс нужно вновь экстрагировать.