1. Органическую и водную фазы при выделении крупных ДНК (>20 kb) нужно смешивать осторожным качанием, переносить ДНК из одной пробирки в другую следует пипеткой с расширенным носиком.

2. Если ДНК сразу не выделилась, необходимо охладить раствор до -20°С и выдержать при этой температуре 30-60 мин. Если ДНК присутствует в небольших количествах (меньше 0,1 мкг/мл), необходимо увеличить время охлаждения или понизить температуру до -70°С. Центрифугируют при температуре +4°С. Удаляют надосадочную жидкость. ДНК высушивают на воздухе и растворяют в 1хТЕ буфере либо в дистиллированной воде.

Проверка ДНК на концентрацию, нативность, подвижность

Концентрацию и нативность ДНК определяют в 1%-ном агарозном геле электрофоретическим методом.

К 2-5 мкл выделенной ДНК добавляется соответствующее количество десятикратного буфера (0,25% бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол, 25% фикол) до однократной концентрации. Приготовленный препарат ДНК вносят в лунки геля. Электрофорез проводят при напряжении 40-60 В в течение 1-2 ч. Визуализируют ДНК на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм. Концентрацию оценивают по яркости свечения полосы высокомолекулярной ДНК в геле в сравнении с известной концентрацией маркерной ДНК. О нативности (отсутствие деградации) ДНК свидетельствует отсутствие шлейфа. ДНК должна выйти из лунки в гель (подвижность). Наличие примесей РНК проявляется в виде пятен в низкомолекулярной зоне.

Амплификация фрагмента гена В LAD (метод ПЦР)

Используют праймеры: 5'-TGAGACCAGGTCAGGCATTGCGTTCA3, (сенс-праймер) и S’-CCCCCAGCTTCTTGACGTTGACGAGGTW (антисенс-праймер), позволяющие получать ПЦР-продукт длиной 132 п.н.

ПЦР проводят в объеме 25 мкл с 50-100 нг геномной ДНК. Реакционная смесь содержит также 50 мМ КС1; 10 мМ Tris, pH 8,4; 2 мМ MgCl 2； 25 пкМ праймеров; 100 мкМ каждого dNTP и 1 ед. акт. Т aq-пол имеразы.

Реакционную смесь без dNTPs прогревают 3 мин при температуре 93°С, добавляют dNTPs и проводят амплификацию в следующих условиях: при 93°С — 60 с, при 62°С 一 60 с, при 72°С — 50 с, 35 циклов.

Оценка результатов ПЦР

Концентрация и специфичность амплификата (фрагмент гена BLAD) оценивается электрофоретическим методом в 2%-ном агарозном геле, при напряжении 40 В в течение 1 ч.

Для идентификации амплифицированного фрагмента, полученного из 100 нг геномной ДНК, достаточно нанести на гель 5 мкл амплификата, смешанного с 1 мкл 1 0 х буфера для нанесения проб на гель.

Визуализируют амплифицированный фрагмент с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм. В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной Alul. Амплифицированный фрагмент гена BLAD имеет яркое, четко видимое свечение. Длина фрагмента составляет 132 п.н., он располагается в геле между полосами маркера 226 и 1 0 0 п.н.

Анализ амплификатов на наличие мутации

гена В LAD

Продукты ПЦР делят на две части. Одну аликвоту обрабатывают TaqI, другую — НаеШ. Электрофорез проводят в 4-5%-ном агарозном геле.

В реакционную смесь вносят:

2 мкл 1 0 х буфера для данной рестриктазы;

1 мкл фермента;

BSA до конечной концентрации 0,1 мг/мл;

5 мкл амплификата;

объем доводится водой до 2 0 мкл.

Реакционную смесь ставят на ночь в термостат при температуре 37°С.

Фрагменты рестрикции разделяются электрофоретическим методом при напряжении 40 В в течение 2 ч.

В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой Alul.

Результаты анализа гена В LAD методом ПЦР - ПДРФ

Амплификаты из ядерной ДНК должны представлять собой полосу длиной 132 п.н.

После рестрикции полученных амплификатов на электрофореграмме должна наблюдаться следующая картина:

Животные, гомозиготные по нормальному аллелю гена BLAD, имеют генотип NN (нормальный аллель обозначают как N). Они здоровы и не являются носителями мутации.

Появление дополнительных сайтов рестрикции и, соответственно, появление дополнительных фрагментов ДНК на электрофорезном геле свидетельствует о том, что в результате точковой мутации произошла замена основания А — аденина на основание G — гуанин в гене, ответственном за проявление BLAD-синдрома. Мутантный аллель обозначается как В.

У гетерозиготной особи в геноме присутствуют два аллеля гена BLAD, один — поврежденный мутацией (В), другой — не поврежденный (N). Это генотип NB. Фенотипически такие животные являются здоровыми, но несут в своем генотипе рецессивный мутантный аллель.

Животные с двумя мутантными аллелями (генотип ВВ) являются носителями мутации и неизлечимо больны.

Необходимое оборудование

1. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением.

2. Микроцентрифуга типа «Эппендорф».

3. Термостат.

4. Прибор для горизонтального гель-электрофореза с источником постоянного тока, кювета для формирования агарозного геля, гребенки для формирования лунок в геле, подложки для геля.

5. Трансиллюминатор с фотоаппаратом или видеокамерой.

6. 6 . Морозильник (-20°С).