Реакционную смесь без dNTPs прогревают 3 мин при температуре 93°С, добавляют dNTPs и проводят амплификацию в следующих условиях: при 93°С — 60 с, при 62°С 一 60 с, при 72°С — 50 с, 35 циклов.
Оценка результатов ПЦР
Концентрация и специфичность амплификата (фрагмент гена BLAD) оценивается электрофоретическим методом в 2%-ном агарозном геле, при напряжении 40 В в течение 1 ч.
Для идентификации амплифицированного фрагмента, полученного из 100 нг геномной ДНК, достаточно нанести на гель 5 мкл амплификата, смешанного с 1 мкл 1 0 х буфера для нанесения проб на гель.
Визуализируют амплифицированный фрагмент с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ-свете с длиной волны 260 нм. В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной Alul. Амплифицированный фрагмент гена BLAD имеет яркое, четко видимое свечение. Длина фрагмента составляет 132 п.н., он располагается в геле между полосами маркера 226 и 1 0 0 п.н.
Анализ амплификатов на наличие мутации
гена В LAD
Продукты ПЦР делят на две части. Одну аликвоту обрабатывают TaqI, другую — НаеШ. Электрофорез проводят в 4-5%-ном агарозном геле.
В реакционную смесь вносят:
2 мкл 1 0 х буфера для данной рестриктазы;
1 мкл фермента;
BSA до конечной концентрации 0,1 мг/мл;
5 мкл амплификата;
объем доводится водой до 2 0 мкл.
Реакционную смесь ставят на ночь в термостат при температуре 37°С.
Фрагменты рестрикции разделяются электрофоретическим методом при напряжении 40 В в течение 2 ч.
В качестве маркера используется ДНК плазмиды pBR322, расщепленной рестриктазой Alul.
Результаты анализа гена В LAD методом ПЦР - ПДРФ
Амплификаты из ядерной ДНК должны представлять собой полосу длиной 132 п.н.
После рестрикции полученных амплификатов на электрофореграмме должна наблюдаться следующая картина:
| Аллели | Фрагменты TaqI | рестрикции (п.н.) НаеШ |
|---|---|---|
| NN | 71,61 | 87, 45 |
| NB | 132, 71，61 | 87, 6 8 , 45, 19 |
| ВВ | 132 | 6 8 , 45, 19 |
Животные, гомозиготные по нормальному аллелю гена BLAD, имеют генотип NN (нормальный аллель обозначают как N). Они здоровы и не являются носителями мутации.
Появление дополнительных сайтов рестрикции и, соответственно, появление дополнительных фрагментов ДНК на электрофорезном геле свидетельствует о том, что в результате точковой мутации произошла замена основания А — аденина на основание G — гуанин в гене, ответственном за проявление BLAD-синдрома. Мутантный аллель обозначается как В.
У гетерозиготной особи в геноме присутствуют два аллеля гена BLAD, один — поврежденный мутацией (В), другой — не поврежденный (N). Это генотип NB. Фенотипически такие животные являются здоровыми, но несут в своем генотипе рецессивный мутантный аллель.
Животные с двумя мутантными аллелями (генотип ВВ) являются носителями мутации и неизлечимо больны.
Необходимое оборудование
-
Низкоскоростная центрифуга с охлаждением.
-
Микроцентрифуга типа «Эппендорф».
-
Термостат.
-
Прибор для горизонтального гель-электрофореза с источником постоянного тока, кювета для формирования агарозного геля, гребенки для формирования лунок в геле, подложки для геля.
-
Трансиллюминатор с фотоаппаратом или видеокамерой.
-
6 . Морозильник (-20°С).
- Электрическая плитка.
8 . Бидистиллятор.
-
Весы технические до 500 г.
-
pH-метр или универсальная индикаторная бумага.
11 • Аппарат для перегонки фенола (круглодонная колба с тремя шлифами, суховоздушный холодильник, асбест для изоляции холодильника, электрическая плитка).
-
ДНК — амплификатор (термоциклер).
-
Пробирки типа «Эппендорф» на 1,5 мл и 0,5 мл.
- Вариационные пипетки 0,5-10 мкл, 5-40 ， 40-200 ， 100-
1 0 0 0 мкл.
-
Мерные колбы на 2, 1 0,5 л, мерные стаканы на 1 л, 0,5 л, цилиндры мерные 100 мл, пипетки на 1 5, 10 мл.
-
Перчатки резиновые.
Нормы
Производительность труда по данной методике составит
50 проб в месяц на одного сотрудника лаборатории.
5. Цитогенетический метод выявления аномалий у крупного рогатого скота
Позволяет выявить численные нарушения кариотипа и хромосомные перестройки у аномальных потомков и их родителей.
Для предотвращения распространения вредных аберраций, повреждений хромосом необходим систематический контроль (мониторинг) за состоянием кариотипов у основной воспроизводящей части популяций.
Изучение кариотипа у аномальных животных и их родителей проводят для обнаружения хромосомных и геномных мутаций, структурных изменений хромосом и количественных изменений кариотипа как причины фенотипических аномалий.
5.1. Необходимые материалы
-
Питательные среды для культивирования лейкоцитов (игла, N 199, RPMI 1640 или их смесь).
-
Реактивы.
