Реактивы

1. Митогены (фитогемагглютинин, Concanavalin А).

2. 2 . Гепарин.

3. КС1.

4. Метиловый или этиловый спирт.

5. 5 . Ледяная уксусная кислота.

6. 6 . Антибиотики (пеницилин и стрептомицин).

7. Красители азур и эозин (краситель Романовсного).

8. 8 . Краситель Гимза.

9. Краситель акридиновый оранжевый.

5.2. Правила получения и хранения биологического материала для цитогенетического анализа

Биологическим материалом для проведения цитогенетического анализа служат лейкоциты и лимфоциты периферической крови. Общим правилом взятия биологического материала является обязательное соблюдение стерильности при взятии крови.

Взятие и доставка образцов крови

Периферическая венозная кровь в количестве 5-10 мл забирается в стерильный одноразовый шприц и переносится в стерильную пробирку или флакон с 0 , 05 - 0,1 мл стандартного раствора гепарина (5000 ЕИ в 1 мл). У крупного рогатого скота кровь берется стерильной одноразовой системой во флакон из яремной вены.

Перед взятием крови поверхность кожи в месте введения иглы стерилизуют 70%-ным спиртом. Вся процедура взятия крови должна быть проведена с максимальным соблюдением стерильности.

Образцы крови помещают в сумку-холодильник или термос при температуре 2-4°С и направляют в лабораторию в течение 1-2 ч с момента взятия биологического материала.

К образцам прилагается ведомость с указанием даты взятия крови, клички, индивидуального номера животного, родителей, возраста, породы.

5.3. Правила и методы проведения цитогенетического анализа

Цитогенетический анализ животных проводят в несколько этапов:

культивирование лимфоцитов для получения достаточного количества клеток на стадиях ранней метафазы, метафазы;

фиксация клеток и приготовление препаратов хромосом; окраска препаратов хромосом;

анализ препаратов хромосом, кариотипирование;

заключение о генетическом состоянии животного.

Культивирование лейкоцитов периферической крови

Постановка культуры клеток

Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.

Во взятой крови осаждают эритроциты центрифугированием в течении 5-10 мин при скорости 1000 мин'1. Образовавшийся слой лейкоцитов и плазму собирают и переносят во флаконы. Для культивирования лейкоцитов во флаконы добавляют по 5-6 мл культуральной среды, содержащей митоген, в пропорции, соответствующей типу и марке митогена, и антибиотики.

При культивировании лейкоцитов свиней в качестве митогена используют фитогемагглютинин. Для некоторых видов крупного рогатого скота, лошадей, кроликов целесообразнее использовать конконовалин А или смесь нескольких митогенов. При культивировании лейкоцитов обычно используют смесь пенициллина со стрептомицином из расчета 50-100 МЕ/мл.

Флаконы с клетками в культуральной среде плотно закрывают крышками и помещают в термостат при температуре 37,5-38,539,0°С на 72 ч.

Постановка культуры лейкоцитов должна происходить в стерильных условиях в культуральном боксе или в настольном ламинарном боксе.

За 1-3 ч до окончания культивирования в каждый флакон добавляется колхицин из расчета 0,35 мкг на 1 мл культуры

39

(обычно используют маточный раствор с концентрацией 0 , 1 мг/мл). Завершение культивирования колхицинированных клеток проходит в термостате при заданной температуре.

Все последующие обработки клеток выполняют без соблюдения условий стерильности.

По окончании культивирования взвесь клеток центрифугируют в течение 5-10 мин при 1000 мин"1. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,075 М КС1, затем клетки подвергают гипотонической обработке в течение 5-15 мин при температуре 38°С, или 30-55 мин при комнатной температуре.

Фиксация клеток

После гипотонической обработки суспензию клеток центрифугируют в течение 1 0 мин при 1 0 0 0 мин'1, надосадочную жидкость удаляют, осадок фиксируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе — смеси метанол-уксусная кислота (3:1). Клетки ресуспендируют в фиксаторе, затем центрифугируют в течение 10 мин. Фиксацию проводят 2-3 раза. Зафиксированные клетки ресуспендируют и хранят в фиксаторе в холодильнике. Сохранять зафиксированные клетки перед приготовлением препаратов можно в течение 1-3 дней. Увеличение срока хранения приводит к ухудшению качества метафазных пластинок на препаратах.

Приготовление препаратов хромосом

Перед приготовлением препаратов необходимо поменять в пробирках фиксатор. Зафиксированные клетки тщательно ресуспендируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе. Несколько капель клеточной суспензии с помощью пастеровской пипетки наносят на предметное стекло. Предметные стекла для хромосомных препаратов должны быть тщательно вымыты и затем обезжирены в растворе хромпика. Перед приготовлением препаратов стекла тщательно промываются в проточной воде и затем в нескольких сменах дистиллированной воды. Отмытые стекла охлаждают в дистиллированной воде в холодильнике.