(обычно используют маточный раствор с концентрацией 0 , 1 мг/мл). Завершение культивирования колхицинированных клеток проходит в термостате при заданной температуре.
Все последующие обработки клеток выполняют без соблюдения условий стерильности.
По окончании культивирования взвесь клеток центрифугируют в течение 5-10 мин при 1000 мин"1. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,075 М КС1, затем клетки подвергают гипотонической обработке в течение 5-15 мин при температуре 38°С, или 30-55 мин при комнатной температуре.
Фиксация клеток
После гипотонической обработки суспензию клеток центрифугируют в течение 1 0 мин при 1 0 0 0 мин'1, надосадочную жидкость удаляют, осадок фиксируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе — смеси метанол-уксусная кислота (3:1). Клетки ресуспендируют в фиксаторе, затем центрифугируют в течение 10 мин. Фиксацию проводят 2-3 раза. Зафиксированные клетки ресуспендируют и хранят в фиксаторе в холодильнике. Сохранять зафиксированные клетки перед приготовлением препаратов можно в течение 1-3 дней. Увеличение срока хранения приводит к ухудшению качества метафазных пластинок на препаратах.
Приготовление препаратов хромосом
Перед приготовлением препаратов необходимо поменять в пробирках фиксатор. Зафиксированные клетки тщательно ресуспендируют в свежеприготовленном и охлажденном фиксаторе. Несколько капель клеточной суспензии с помощью пастеровской пипетки наносят на предметное стекло. Предметные стекла для хромосомных препаратов должны быть тщательно вымыты и затем обезжирены в растворе хромпика. Перед приготовлением препаратов стекла тщательно промываются в проточной воде и затем в нескольких сменах дистиллированной воды. Отмытые стекла охлаждают в дистиллированной воде в холодильнике.
Клеточную суспензию раскапывают на мокрое и холодное стекло и высушивают при комнатной температуре. От одного животного готовят, по возможности, от четырех до десяти стекол. Готовые препараты хранят в плотно закрытых коробках при комнатной температуре или в холодильнике, в зависимости от дальнейших обработок.
Окраска и анализ препаратов хромосом
Окраска препаратов хромосом
При анализе кариотипа сельскохозяйственных животных используют несколько типов окраски хромосом. Рутинная окраска, при которой хромосомы окрашены однородно, позволяет провести первоначальный анализ хромосомного набора животного. При обнаружении каких либо нарушений структуры или количества хромосом в наборе необходимо проводить более детальный анализ, используя методы дифференциального окрашивания. Наиболее приемлемыми вариантами дифференциальной окраски для генетической экспертизы являются G-окраска и R-окраска, позволяющие выявить четкую дисковую исчерченность строго специфичную для каждой хромосомы.
Рутинная окраска
Для рутинного анализа хромосом на световом микроскопе препараты окрашивают азур-эозином по Романовскому или красителем Г имза. Для этого препараты помещают на 6-10 мин в 2%-ный раствор красителя Г имза в фосфатном буфере ( Na 2 Н Р04 : КН 2 РО 4 ), pH 6 ,8 . Контроль окрашивания проводят под микроскопом. Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой и высушивают. Анализировать с помощью микроскопа можно только полностью высушенные препараты, используя объективы 25 и 90.
Дифференциальная окраска G-mun
G-окраска может выполнятся несколькими методами. Наиболее приемлемым является метод Раджабли и Крюкова (1973), разработанный на основе методов Seabright (1971) и Evans et al.
(1971). Препараты на 10-60 с помещают в 0,25%-ный раствор трипсина, нагретый до температуры 35°С. После обработки трипсином препараты отмывают в буфере 2-SSC (0,6 М NaCl — 0,06 М цитрат натрия), переносят в чашку Петри со свежей порцией того же буфера, и инкубируют в течение 1 ч при температуре 62°С. После инкубации препараты прямо из буфера переносят в раствор красителя Г имза, приготовленного следующим образом: 2 мл основного красителя разводят в 50 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл 0,1% Na2 Co3 . Препараты окрашиваются в вертикальном положении в течение 5-15 мин при контроле под микроскопом. После окрашивания препараты ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Хромосомный анализ проводят на световом микроскопе при увеличении 90х, используя стандартные карты G-исчерченных хромосом.
Дифференциальная окраска R-muna
Дифференциальная сегментация хромосом R-типа по своей картине в точности противоположна G-сегментации: негативные диски при G-окраске соответствуют позитивным дискам при R- окраске. Варьируя температуру или pH среды при обработке препаратов, можно добиться перехода G-окрашивания в R- окрашивание. Вместе с тем R-окрашивание представляет интерес, а в ряде случаев более информативно, поскольку в отличие от G- метода интенсивно окрашиваются терминальные участки хромосом. Это позволяет получить отчетливо обозначенные концы хромосом, что важно при описании делеций и точек разрывов в хромосоме при транслокациях.
Среди ряда методов R-окрашивания наиболее информативным является RBA метод с использованием акридинового оранжевого. Принцип этого метода заключается в преимущественном окрашивании участков хромосом содержащих тимидин. Для этого за 7 ч до завершения культивирования, то есть во вторую половину s-фазы цикла клеточного деления, в культуру вводится бромдезоксиуридин (БДУ) в конечной концентрации 25 мкг/мл, который встраивается в поздно реплицирующие участки хромосом.
Для получения максимального числа дисков на хромосомах и хорошо различимого чередования позитивных и негативных дис- 42
