ков целесообразнее использовать для дифференциального окрашивания не метафазные, а профазные и прометафазные хромосомы. Для этого за 1-3 ч до завершения культивирования вместе с колхицином во флаконы необходимо ввести этидиум бромида в конечной концентрации 10-15 мкг/мл. Это позволяет накопить в культуре клетки, находящиеся преимущественно на ранних стадиях митоза.
Препараты для получения данного типа окрашивания высушиваются на воздухе, без применения высокой температуры, и выдерживаются при комнатной температуре в течение 1 0 - 1 2 дней для лучшего окрашивания хромосом.
Готовые препараты окрашиваются 0 ,2 %-ным раствором акридинового оранжевого на ОД М фосфатном буфере (pH 7,0) в течение 1-3 мин под покровным стеклом. Затем стекла промываются проточной дистиллированной водой.
Анализ препаратов с R-дифференциальной исчерченностью проводится на флуоресцентном микроскопе при увеличении 25х и 90х используя стандартные карты R-исчерченных хромосом.
Анализ препаратов хромосом
Анализ препаратов хромосом проводят на световом или люминесцентном (в случае использования дифференциальной окраски хромосом) микроскопе визуально при увеличении 25х и 90х, а также на микрофотографиях.
Визуальный анализ хромосом
Для визуального анализа препаратов хромосом применяют рутинную окраску по Г имза.
Метафазные пластинки для хромосомного анализа (как визуального анализа, так и для кариотипирования) должны соответствовать ряду требований. На стекле выбирают метафазные пластинки только округлой формы, с хорошо заметной границей кариоплазмы. Хромосомы должны быть равномерно распределены внутри метафазной пластинки, не должны иметь накладок и выбросов за пределы кариоплазмы. Вблизи анализируемой метафазной пластинки не должно быть единичных хромосом или групп из нескольких хромосом. Степень спирализации хромосом должна по
зволять достоверно идентифицировать самые маленькие хромосомы набора.
При первоначальном анализе (используется рутинная окраска по Романовскому-Гимза) в 30-40 метафазных пластинках, визуально подсчитывают число хромосом. На этом этапе подсчитывают модальное число хромосом, определяют маркерные хромосомы и генетический пол животного по составу половых хромосом. Затем фотографируют несколько типичных метафазных пластинок. На микрофотографиях проводят анализ кариотипа и подтверждают данные первоначального визуального анализа. В случае, если возникает подозрение на присутствие конституциональных аномалий или значительных спонтанных изменений кариотипа, фотографируют от 30 до 50 метафазных пластинок.
Микрофотографирование препаратов хромосом
Микрофотографирование проводят на фотопленку микрат Орто (микрат 200) или микрат 300 (в зависимости от применяемой окраски хромосом). Для проявления фотопленок и печати фотографий используют стандартные проявители и закрепители.
На основании визуального анализа дают следующие характеристики животного: модальное число хромосом; генетический пол; наличие или отсутствие конституциональных нарушений кариотипа (транслокаций, центрических слияний, делеций и инверсий хромосом); частоту гипо- и гиперплоидных клеток; частоту полиплоидных клеток; частоту клеток со спонтанными структурными аберрациями хромосом.
Эти характеристики позволяют с высокой степенью точности оценить генетическое состояние животного, наличие или отсутствие у него генетического груза и племенной ценности.
При наличии у животного конституциональных аномалий хромосом, а также при высоком уровне спонтанных нарушений кариотипа используют дифференциальное окрашивание хромосом и проводят кариотипический анализ на 30-40 микрофотографиях для каждого животного.
Кариотипический анализ
Кариотипический анализ позволяет точно идентифицировать каждую хромосому набора, определить гомологичные хромосомы 44
и пронумеровать хромосомы, согласно стандартной номенклатуре кариотипа.
В зависимости от предполагаемого типа аномалии хромосом выбирают один из предложенных типов дифференциального окрашивания. Если предполагаются нарушения дистальных участков хромосом, то необходимо использовать дифференциальную окраску R-типа.
При кариотипическом анализе используют карты дифференциально исчерченных хромосом стандартного кариотипа. Дифференциальный рисунок каждой хромосомы исследуемого животного сопоставляют со стандартным рисунком, находят гомологичные хромосомы и присваивают каждой паре хромосом порядковый номер.
Кариотипический анализ позволяет точно определить у каждого животного: модальное число хромосом; генетический пол; наличие или отсутствие хромосомных аберраций; номер и участок хромосомы, с точностью до одного диска, затронутой обнаруженной аберрацией; частоту гипо- и гиперплоидных клеток; номера утраченных или дополнительных хромосом в клетке; частоту клеток со спонтанными структурными аберрациями хромосом; номер хромосомы со структурной аберрацией и точное местоположение измененного участка хромосомы.
5.4. Описание хромосомного набора крупного рогатого скота
Кариотип крупного рогатого скота состоит из 60 хромосом, 29 пар аутосом и половые хромосомы — 2n=60, X Y. Все аутосомы данного кариотипа представлены акроцентрическими хромосомами, постепенно убывающих в размерах. Поэтому идентификация отдельных аутосом крупного рогатого скота при рутинной окраске невозможна, для идентификации хромосом применяют дифференциальную окраску. X хромосома — крупный субметацентрик, у- хромосома — самая маленькая хромосома — субметацентрик. Эти хромосомы возможно идентифицировать при рутинной окраске. При рутинной окраске возможно идентифицировать только половые хромосомы: Х-хромосому — крупный субметацентрик и у- хромосому — самая маленькая хромосома набора. Идентификация отдельных аутосом крупного рогатого скота при рутинной окраске
