ВВЕДЕНИЕ

Одной из причин, сдерживающих успешное развитие животноводства, являются факторные болезни, имеющие сложную этиологию и отрицательно влияющие на технологические процессы. По мнению многих ученых к ним относится и пастереллёз. В Казахстане пастереллез является одной из наиболее распространенных инфекций, наносящей значительный экономический ущерб болезнью домашних животных и птиц.

Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на сегодняшний день разработаны и применяются различные культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики, остается актуальной проблемой и до настоящего времени. При этом данная задача совпадает со стратегией Правительства РК, взявшего курс на разработку инновационных решений, обеспечивающих раннюю диагностику с применением высокотехнологичных экспресс - методов. В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей участков ДНК.

К настоящему времени в Российской Федерации для ПЦР налажено производство высокоспецифичных, стандартизированных тест-систем (наборов) для обнаружения большинства патогенных микроорганизмов в биологических средах, однако их доступность и стоимость сдерживают широкое использование этих методов; тест – системы на пастереллез на рынке ветеринарных диагностикумов России и Казахстана - нет.

Тест-системы, предназначенные для постановки ПЦР, основаны на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать фрагменты ДНК патогенных для человека и животных бактерий и вирусов, даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим,

бактериологическим, микроскопическим и др.) их выявление невозможно.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики пастереллеза животных [1,2,3,4,5]. Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики пастереллеза крупного рогатого скота является весьма актуальной проблемой для Казахстана. Необходимо создать отечественную ПЦР систему для детекции ДНК пастереллеза крупного рогатого скота. В РК аналогичные работы до настоящего времени не проводились.

Целью работы являлась разработка лабораторного метода ПЦР для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота, c использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.

Были определены основные этапы исследований:

1 Провести мониторинг вспышек пастереллеза крупного рогатого скота в Костанайской области;

2 Изучить основные биологические свойства эпизоотических культур Pasteurella multocida, отобрать наиболее консервативные штаммы с целью создания праймера;

3 Отработать оптимальные методы выделения ДНК Pasteurella multocida;

4 Провести рестрикционный анализ с целью фрагментации бактериальной ДНК и определения ее молекулярной массы;

5 Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные специфические праймеры для амплификации участка геномной ДНК возбудителя пастереллеза КРС;

6 Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временной и температурный режим реакции, концентрации основных компонентов в реакционной смеси) при выявлении ДНК возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота;

7 Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при выявлении ДНК возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика, распространенность

пастереллеза

Пастереллез – широко распространенная инфекционная болезнь, поражающая многие виды домашних и диких животных и проявляющаяся при остром течении симптомами септицемии, с образованием множественных кровоизлияний на серозных и слизистых покровах дыхательных путей и пищеварительного тракта.

Вызывают пастереллезы разные биотипы и сероварианты возбудителей из рода Pasteurella, нередко в ассоциации с другой условно-патогенной микрофлорой, вирусами и грибами.

Пастереллы играют весьма существенную роль в патологии сельскохозяйственных животных. Инфекционная природа болезни была установлена только в середине ХIХ века. Большая работа по пастереллезу была проведена Пастером (1880), который установил возбудителя этого заболевания, получил микроорганизм в чистой культуре и разработал активную специфическую профилактику. Выделенный микроорганизм назван в честь Луи Пастера – пастереллой, а вызываемое им заболевание - пастереллезом. От крупного рогатого скота пастереллы выделены Киттом в 1885 году, от буйволов – Орестом и Арман в 1887 году, от овец – Линьером в 1896 году, от свиней – Леффлером и Шютцем в 1885 году [6], от кроликов – Гаффки в 1883 году [7].

По классификации Международного эпизоотического бюро  МЭБ  в 1979 году пастереллез крупного рогатого скота был включен в список В как менее опасное, но достаточно широко распространенное среди крупного рогатого скота, после лейкоза, туберкулеза, бруцеллеза инфекционное заболевание  8  . Болезни списка В– контагиозные болезни, которые считаются опасными с социально-экономической и санитарной точек зрения. Занос возбудителей этих инфекций при международной торговле животными и продуктами животноводства может иметь крайне неблагоприятные последствия. Пастереллез распространен во всех странах мира. К наиболее неблагополучным по пастереллезу крупного рогатого скота зонам относятся Южная часть Европы, Африканский континент, Средний Восток, Юг и ЮгоВосточная Азия.

Интенсивные исследования, проведенные во многих направлениях в течение нескольких десятков лет, коренным образом изменили существовавшее представление и значительно расширили познания о пастереллезах сельскохозяйственных животных.

По мнению С.И. Джупины, А.А. Колосова (1992), В.А. Салимова (2007) пастереллез можно отнести к факторным болезням,