Нами был опробован способ выделения ДНК методом горячего лизиса агаровой культуры пастерелл на водяной бане описанный в статье W. L. Araujo, D.A. de Angellis, J.L. Azevedo “Direct RAPD Evalution of Bacteria without Conventional DNA Extraction” [223]. Данный метод очень прост в исполнении: ДНК выделяется методом горячего лизиса - 50 мкл культуры инкубируется 10 минут на водяной бане, и хотя метод не дает высокую степень очистки экстрагированной ДНК (1,65-1,7), может использоваться при рутинной диагностической работе. Выход геномной ДНК при данном методе составлял 60-80 %. Таким образом, результаты качественного и количественного анализа показали, что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.
2.3.2 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых материалов
Выделение ДНК из цельной крови проводили двумя методами: перхлоратным методом и методом щелочного лизиса. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida в обоих случаях имело средние значение 1,84 0,04 (рисунок 12).
Примечание - 1 – геномная ДНК Pasteurella multocida ; М – маркер ДНК "Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.", Sigma. Рисунок 12 - Электрофореграмма препарата ДНК Pasteurella multocida перхлоратным методом и методом щелочного лизиса
Из полученных результатов видно, что в образцах на агарозном геле присутствуют полосы, соответствующие высокомолекулярной ДНК, а также отсутствуют следы деградации ДНК и низкомолекулярные фрагменты.
В целях выделения ДНК из органов применяли метод Кавасаки. Была получена высокомолекулярна ДНК с отличной степенью очистки. Качество очистки препарата было дополнительно проанализировано по оптической экстинкции в ультрафиолетовом спектре при длине волны 260нм - 320 нм.
Таким образом, определены оптимальные методы выделения ДНК для дальнейшего проведения исследований по разработке метода ПЦР для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота.
2.4 Реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida
Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. Большое разнообразие существующих эндонуклеаз рестрикции позволяет проводить расщепление ДНК по более 150 сайтам узнавания. Одним из важных элементов рестрикционного анализа является получение теоретически рассчитанной картины разделения фрагментов ДНК, определяемой на основе известной первичной структуры данной ДНК.
В наших экспериментах рестрикционный анализ проводили для определения молекулярной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярный размер нуклеиновых кислот бактерий достаточно большой – более 2 миллионов пар оснований.
Очень важно, чтобы выделенная ДНК была нефрагментированной, так как в дальнейших экспериментах она будет служить матрицей для синтеза специфического продукта.
Целью данного этапа работы являлось подобрать оптимальную рестриктазу и условия рестрикции, провести анализ и обработку электрофореграмм. На конечном этапе работы предполагалось определить молекулярную массу геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90 и сравнить с данными литературы.
Первоначально были проведены эксперименты по выбору оптимальных ферментов рестрикции ДНК Pasteurella multocida и подбору оптимальных условий рестрикции. В экспериментах при выборе ферментов для расщепления ДНК Pasteurella multocida использовали рестриктазы Apa I, Ceu I, NotI. Характеристики рестриктаз представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Характеристика использованных в работе рестрикционных эндонуклеаз
| Рестриктазы | Ионная сила | Сайты узнавания | Образование концов | Т инкубации, С |
|---|---|---|---|---|
| Apa I | Средн. | CAAGCTT | липкие | 37-55 |
| Ceu I | Высок. | (A/G)(A/G)A T(T/C)(T/C) | тупые | 37- 50 |
| NotI | Низкая | CGTACG | липкие | 37 -55 |
Реакционная смесь: в одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК Pasteurella multocida, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с рестриктазами фирмы "Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см3 ). В ходе опытов было опробовано несколько температурных режимов инкубации реакционной смеси. В результате экспериментов для расщепления ДНК оптимальной температурой инкубирования оказалось 370 С в течение 2 ч.
На рисунке 12 представлен результат опыта по рестрикции генома Pasteurella multocida штамм 90 различными эндонуклеазами.
Примечание - Ceul (1), ), Notl /Ceul (2), Notl (3), ApaI/ Ceul (4) и ApaI (5).справа М – маркер стандартных размеров ДНК в килобазах, слева М- маркер, ДНК фага , обработанная HindIII
Рисунок 13 - Электрофореграмма гидролизатов ДНК Pasteurella multocida, полученных с помощью обработки рестриктазами
