2.3 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida

2.3.1 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из бактериальных культур

Нами проведены исследования по отработке оптимальных методов экстрагирования бактериальной ДНК. При диагностике пастереллеза КРС методом ПЦР основным рабочим материалом, как уже упоминалось, является ДНК Pasteurella multocida. Основным критерием в методах выделения ДНК является то, что нуклеиновая кислота должна быть максимально очищенной от примесей клеточных ДНК и белков. Выделенная геномная ДНК должна нефрагментированной, так как она служит матрицей для синтеза специфического продукта.

Как известно, в прокариотической клетке генетический материал (ДНК) локализован в довольно неупорядоченном, не окруженном мембраной тельце, называемом нуклеоидом . Для исследования свойств нуклеиновой кислоты бактерии в растворе необходимо выделить ее из бактериальной клетки. Для этого используют такие методические приемы, которые позволяют разрушить различного типа связи между субъединицами белковой оболочки бактериальной частицы, между нуклеиновой кислотой и белком. В методическом сборнике «PCR Protocols» наиболее часто для выделения нативной ДНК прокариотов рекомендуют детергентно-ферментные методы с последующей экстракцией фенолом [223]. Детергенты - растворимые в воде полярные липиды. Обычно они классифицируются по типу гидрофильной группы: анионные, катионные, амфотерные и неионные. Ионные детергенты (Nonidet P-40, Тween 80) лучше денатурируют белки, чем неионные.

Townsend KM, Frost AJ, Lee CW, Papadimitriou JM, Dawkins HJ. [206] в своих работах описывают метод экстракции ДНК с использованием детергента Тween 20. Carol A. Lichtensteiger, Susan M. Steenbergen в статье “Direct PCR Analisis for Toxigenic Pasteurella multocida” [224] остановились на методе изоляции ДНК Pasteurella multocida с использованием детергента Nonidet P-40.

В наших исследованиях по подбору оптимальной схемы выделения ДНК из культур Pasteurella multocida были использованы следующие методы:

• детергентно-ферментный метод с использованием додецилсульфата с последующей экстракцией фенол/хлороформом;

• с применением детергента и последующей экстракцией фенолом.

• использование лизирующего буфера, содержащий и с дальнейшей экстракцией фенол/хлороформом;

• метод кипячения.

Первый способ основан на использовании фермента протеиназы К для лизиса белковых структур с дальнейшей фенольной депротеинизацией. Второй способ экстракции ДНК из бактерий предусматривает использование в качестве детергента Тween - 20. Тween хорошо лизирует клеточную мембрану, но слабее действует на ядерную стенку, если учесть, что в бактериальных клетках ядро не имеет оболочки – это оптимальный вариант.

При применении третьего метода в качестве детергента использовали Nonidet P-40. Главными критериями при отработке оптимальных методов были концентрация и чистота препарата.

После выделения ДНК Pasteurella multocida вышеперечисленными методами проводили качественный и количественный анализ образца. Электрофорез проводили в 0,8 % агарозном геле в ТАЕ-буфере. Спектрофотометрически измеряли отношение между оптическими плотностями при 260 и 280 нм. Максимум поглощения для нуклеиновых кислот регистрируется при длине волны 260 нм. Препарат ДНК считается свободным от примесей при величине отношений Е260/280 равным 1,8 и выше. Если этот показатель ниже указанного, то образец загрязнен белками или фенолом.

Образцы ДНК Pasteurella multocida, полученные с использованием детергентов Nonidet P-40 и Тween - 80, оказались невысокого качества. Отношения между оптической плотностью при длинах волн 260 и 280 нм в среднем составляли 1,65-1,7, что говорило о загрязненности ДНК белком и другими примесями. Таким образом, полученные результаты показали неэффективность этих методов.

Лучшие результаты были получены при обработке бактериосодержащей суспензии детергентом – 10 % раствором додецилсульфата натрия в сочетании с протеиназой К и с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Применение додецилсульфата натрия не только депротеинизирует бактериальную клетку, но также подавляет активность нуклеаз. Клеточные белки удаляли обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К. Для удаления белков и разрыва связей ДНК-белок использовали смесь фенол-хлороформ, который является более сильным средством депротеинизации. Результат качественного анализа полученного препарата ДНК представлен на электрофореграмме (рисунок 10).

Примечание - 1 – геномная ДНК Y.enterocolitica; М – маркер ДНК ". Рисунок 10 - Электрофореграмма геномной ДНК штамма Y.enterocolitica,

Как видно из рисунка ДНК Pasteurella multocida представлена одной четкой линией, что говорит о нативности препарата. Оптимальная схема выделения ДНК Pasteurella multocida при использовании данного метода представлена на рисунке 11.

Инкубация суточной культуры
Pasteurella multocida с протеиназой К
(к/к 100 мкг/см 3 и 0,5 % SDS).
Двухкратная депротеинизация
фенол/ хлороформом , однократная
хлороформом. Центрифугирование
Осаждение ДНК спиртом, в
присутствии ацетата натрия в течение
1 часа при минус 20 0 С
Центрифугирование при 15600 g в
течение 15 мин при для температуре
4 0 С для отделения осадка
Двухкратное промывание осадка
ДНК 70 % спиртом, высушивание и
разведение в ТЕ буфере

Рисунок 11 – Схема выделения ДНК детергентно – ферментным методом.