бактериологическим, микроскопическим и др.) их выявление невозможно.

Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики пастереллеза животных [1,2,3,4,5]. Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики пастереллеза крупного рогатого скота является весьма актуальной проблемой для Казахстана. Необходимо создать отечественную ПЦР систему для детекции ДНК пастереллеза крупного рогатого скота. В РК аналогичные работы до настоящего времени не проводились.

Целью работы являлась разработка лабораторного метода ПЦР для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота, c использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.

Были определены основные этапы исследований:

1 Провести мониторинг вспышек пастереллеза крупного рогатого скота в Костанайской области;

2 Изучить основные биологические свойства эпизоотических культур Pasteurella multocida, отобрать наиболее консервативные штаммы с целью создания праймера;

3 Отработать оптимальные методы выделения ДНК Pasteurella multocida;

4 Провести рестрикционный анализ с целью фрагментации бактериальной ДНК и определения ее молекулярной массы;

5 Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные специфические праймеры для амплификации участка геномной ДНК возбудителя пастереллеза КРС;

6 Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временной и температурный режим реакции, концентрации основных компонентов в реакционной смеси) при выявлении ДНК возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота;

7 Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при выявлении ДНК возбудителя пастереллеза крупного рогатого скота.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Краткая характеристика, распространенность

пастереллеза

Пастереллез – широко распространенная инфекционная болезнь, поражающая многие виды домашних и диких животных и проявляющаяся при остром течении симптомами септицемии, с образованием множественных кровоизлияний на серозных и слизистых покровах дыхательных путей и пищеварительного тракта.

Вызывают пастереллезы разные биотипы и сероварианты возбудителей из рода Pasteurella, нередко в ассоциации с другой условно-патогенной микрофлорой, вирусами и грибами.

Пастереллы играют весьма существенную роль в патологии сельскохозяйственных животных. Инфекционная природа болезни была установлена только в середине ХIХ века. Большая работа по пастереллезу была проведена Пастером (1880), который установил возбудителя этого заболевания, получил микроорганизм в чистой культуре и разработал активную специфическую профилактику. Выделенный микроорганизм назван в честь Луи Пастера – пастереллой, а вызываемое им заболевание - пастереллезом. От крупного рогатого скота пастереллы выделены Киттом в 1885 году, от буйволов – Орестом и Арман в 1887 году, от овец – Линьером в 1896 году, от свиней – Леффлером и Шютцем в 1885 году [6], от кроликов – Гаффки в 1883 году [7].

По классификации Международного эпизоотического бюро  МЭБ  в 1979 году пастереллез крупного рогатого скота был включен в список В как менее опасное, но достаточно широко распространенное среди крупного рогатого скота, после лейкоза, туберкулеза, бруцеллеза инфекционное заболевание  8  . Болезни списка В– контагиозные болезни, которые считаются опасными с социально-экономической и санитарной точек зрения. Занос возбудителей этих инфекций при международной торговле животными и продуктами животноводства может иметь крайне неблагоприятные последствия. Пастереллез распространен во всех странах мира. К наиболее неблагополучным по пастереллезу крупного рогатого скота зонам относятся Южная часть Европы, Африканский континент, Средний Восток, Юг и ЮгоВосточная Азия.

Интенсивные исследования, проведенные во многих направлениях в течение нескольких десятков лет, коренным образом изменили существовавшее представление и значительно расширили познания о пастереллезах сельскохозяйственных животных.

По мнению С.И. Джупины, А.А. Колосова (1992), В.А. Салимова (2007) пастереллез можно отнести к факторным болезням,

являющимися одной из причин, сдерживающих развитие животноводства, имеющих сложную этиологию и отрицательно влияющих на технологические процессы [9,10]. Проявляется пастереллез в виде спорадических случаев, но при условиях, способствующих его распространению, может приобретать характер эпизоотии.

Экономический ущерб от пастереллеза слагается из потерь от падежа, вынужденного убоя больных животных, пастереллоносителей и затрат на проведение профилактических и оздоровительных мероприятий. Летальность при пастереллезе колеблется от 10 до 100% [11,12,13].

К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади, мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки, дикие животные, домашние и дикие птицы. При благоприятных условиях пастереллез развивается и распространяется среди здоровых животных [14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]. Пастереллез распространен повсеместно, но чаще регистрируются в странах с тропическим и субтропическим климатом (Индия, Пакистан, Иран, Ирак, Таиланд, Камерун, Филиппины, Индонезия, Вьетнам, Лаос, Камбоджа, Южная Корея). Достаточно широко пастереллез распространен на территориях стран СНГ, в том числе и в Казахстане [8,10,25,26,27,28,29,30,31]. Определенной устойчивостью к пастереллезу обладают лошади и плотоядные [32,33,34,35,36]. Как самостоятельное заболевание пастереллез у этих видов животных наблюдается редко, но может встречаться в качестве секундарной инфекции, например, при гриппе лошадей, чуме собак. Однако, Керимбаев У.Н., Сансызбаев А.Р., Сидоров М.А., Геведзе В.И., считают, что лошади легко заражаются пастереллезом, при этом болезнь протекает остро и большинство животных погибает [37, 38].

Наиболее широко распространено носительство среди крупного рогатого скота (9,52%), буйволов (5,13%), домашних птиц (4,95%), овец (2,63%), коз (2,56%) и лошадей (1,87%) [39]. В среднем носители выявлены среди здоровых животных и птиц в 3,9%, среди больных с поражением органов дыхания – 4,6% случаев [8,15]. Носительство пастерелл отмечено не только у диких, но и у синантропных грызунов (у 3,1% серых крыс и у 1,9% домовых мышей) [40,41, 42, 43, 44, 45].

Разнообразие пастереллезов по клиническому проявлению и характеру течения связано с широкой серологической и иммунологической гетерогенностью пастерелл.

Poberts .Р. на основе результатов сывороточных тестов защиты на мышах обнаружил иммунологическую гетерогенность культуры P.multocida и таким образом разделил их на четыре типа 1,2,3,4  46  . Д.Картер установил наличие специфического капсульного антигена